amino acids and acylcarnitines from dried blood/derivatized · 2019-05-27 · a tirosinemia tipo 1...

Manual de Instruções para Análise por LC-MS/MS

MassChrom®

Amino acids and acylcarnitines

from dried blood/derivatized Reagente diagnóstico para determinação semi-quantitativa

in vitro de Aminoácidos e Acilcarnitinas em sangue seco

por LC-MS/MS/derivatizado

Somente para uso em diagnóstico in vitro

Artigo 55000

IT 55000 Aminoácidos/Acilcarnitinas PT 11/2018 V9

MassChrom® Amino acids and acylcarnitines

from dried blood/derivatized - LC-MS/MS

MS 10350840263

Importado e Distribuído por: BioSys Ltda.

Rua Coronel Gomes Machado, 358, Centro, Niterói, RJ

CEP: 24020-112

CNPJ: 02.220.795/0001-79

SAC: (21) 3907 2534 – [email protected]

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Fabricado por: Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH

Am Haag 12

D-82166 Gräfelfing

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Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH é certificada de acordo com o DIN EN ISO 9001 e

DIN EN ISO 13485. Os produtos são produzidos e colocados em circulação seguindo as diretrizes

do IVD 98/79/EC.

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Conteúdo ............................................................ Página

1 Informações para requisição ...................................................................................... 4

2 Introdução ....................................................................................................................... 6 2.1 .... Informações Gerais ............................................................................................. 6 2.2 .... Uso pretendido .................................................................................................... 7 2.3 .... Príncipio do kit de reagentes ............................................................................ 7

3 Sistema LC-MS/MS .......................................................................................................... 9 3.1 .... Parâmetros do equipamento ........................................................................... 9 3.2 .... Métodos de medição MS/MS ......................................................................... 11 3.3 .... Otimizando os MRMs assim como os experimentos de Perda Neutra e

Varredura do Íon Precursor (tuning) .............................................................. 12 3.4 .... Procedimento inicial ......................................................................................... 13 3.5 .... Desligando o equipamento (Shut down) ..................................................... 13

4 Transições de massa dos analitos e padrões internos .......................................... 14

5 Preparo da amostra .................................................................................................... 17 5.1 .... Coleta e armazenamento das amostras de pacientes ............................ 17 5.2 .... Reconstituição do padrão interno ................................................................ 18 5.3 .... Manuseio dos controles ................................................................................... 18 5.4 .... Procedimento de preparo das amostras ..................................................... 19

5.4.1 .... Preparo da amostra sem placa filtrante - somente para

amino ácidos e acilcarnitinas ........................................................... 19 5.4.2 .... Preparo da amostra com placa filtrante - somente para

amino ácidos e acilcarnitinas ........................................................... 20 5.4.3 .... Preparo da amostra incluindo succinilacetona ............................ 21

5.5 .... Estabilidade das amostras ............................................................................... 22

6 Materiais requeridos, mas não fornecidos .............................................................. 22

7 Resultados e avaliação .............................................................................................. 22

8 Controle de Qualidade .............................................................................................. 23

9 Valores de Cut-off / referência ................................................................................. 23

10 Fatores de conversão ................................................................................................. 25

11 Armazenamento e estabilidade dos reagentes ................................................... 26

12 Descarte de Resíduos .................................................................................................. 27

13 Exemplos de espectros de massa ............................................................................ 28

14 Interferentes conhecidos ............................................................................................ 31

15 Problemas e Soluções ................................................................................................. 32

16 Literatura ........................................................................................................................ 33


Conteúdo ............................................................ Página

Apêndice I: Informações de Riscos ................................................................................ 34

Apêndice II: Cálculo manual ............................................................................................ 36

Apêndice III: Validação ...................................................................................................... 36 IIIa:.... Preparo sem succinilacetona ......................................................................... 36 IIIb: .... Preparo incluindo a succinilacetona ............................................................ 41

Apêndice IV: Zertifikat .......................................................................................................... 45

Apêndice V: Símbolos.......................................................................................................... 46


1 Informações para requisição

Nº da ordem Produto

55000 MassChrom® Kit de reagentes para análise por LC-MS/MS de Aminoácidos e

Acilcarnitinas em sangue seco para triagem neonatal

Conteúdo para 960 análises com placa padrão de 96 poços:

Fase móvel 2 x 1000 mL

Padrão interno, liofilizado 4 x 25 mL

Reagente derivatização 2 x 30 mL

Tampão reconstituição 1 x 100 mL

Solução de Lavagem 2 x 1000 mL

Tampão de extração 1 x 200 mL

Placa de 96 poços, fundo em V 3 x 10 peças

Folha de proteção para placa de 96 poços 3 x 10 peças

55000/F MassChrom® Kit de reagentes para análise por LC-MS/MS de Aminoácidos e

Acilcarnitinas em sangue seco para triagem neonatal

Conteúdo para 960 análises com placa filtrante de 96 poços:

Fase móvel 2 x 1000 mL

Padrão interno, liofilizado 4 x 25 mL

Reagente derivatização 2 x 30 mL

Tampão reconstituição 1 x 100 mL

Solução de Lavagem 2 x 1000 mL

Solução tampão de extração 1 x 200 mL

Placa filtrante de 96 poços 10 peças

Placa de 96 poços, fundo em V 10 peças

Folha de proteção para placa de 96 poços 10 peças

Folha de proteção em alumínio para placa de 96 poços 10 peças

Componentes disponíveis separadamente

55001 Fase móvel 1000 mL

55002 Fase móvel 10 x 1000 mL

55004/T Padrão interno, liofilizado 1 x 25 mL

55004 Padrão interno, liofilizado 4 x 25 mL

55044 Padrão interno para succinilacetona 3 x 50 mL

55044/T Padrão interno para succinilacetona 1 x 50 mL

55005 Reagente derivatização 30 mL

55006 Tampão reconstituição 100 mL

55007 Solução de Lavagem 1000 mL

55008 Tampão de extração 200 mL

55010 Placa de 96 poços, fundo em V 10 peças

55011 Folha de proteção para placa de 96 poços 10 peças

55057 Placa filtrante de 96 poços 5 peças


Acessórios

55013 Folha adesiva para placa de 96 cavidades 10 peças

55015 Capilar de restrição 1 peça

55016 Colar adaptador para centrifugação 2 peças

55099 Mistura para Tuning, contêm todos os analitos 2 mL

15009 Pré-filtro em PEEK, 5µm 5 peças

15010 Suporte para pré-filtro em PEEK 1 peça

Controles (spots de sangue seco em papel de filtro)

0191 MassCheck® Controle bi-nível (I + II) de aminoácidos e acilcarnitinas, spot 2 x 3

spots

0192 MassCheck® Controle nível I de aminoácidos e acilcarnitinas, spot1 x 3 spots

0193 MassCheck® Controle nível II de aminoácidos e acilcarnitinas, spot1 x 3 spots


2 Introdução

2.1 Informações Gerais

O objetivo da triagem neonatal é o diagnóstico oportuno de doenças metabólicas hereditárias

que não podem ser reconhecidas por sinais externos. A triagem torna possível o tratamento

precoce das doenças e previne danos consequentes o mais rápido possível.

As doenças são causadas por deficiências enzimáticas hereditárias, levando ao decréscimo ou

supressão da atividade enzimática. Desta maneira, os substratos não transformados acumulam-

se no organismo. Dependendo do grau da doença o produto estará presente em níveis

limitados ou completamente ausente no organismo. Isto leva ao acúmulo de metabólitos

potencialmente tóxicos, causando defeitos em órgãos e doenças multissistêmicas (amino e

organoacidopatias). Não diagnosticados, estes distúrbios metabólicos causam lesões severas e

irreversíveis à criança, mesmo em poucos dias. No caso da fenilcetonúria, ocorre retardo físico e

mental da criança afetada. A tirosinemia tipo 1 leva ao acúmulo de metabólitos tóxicos

(especialmente succinilacetona) resultando em doenças severas do fígado durante a primeira

infância.

Entretanto, uma vez que esses defeitos são hereditários, tais doenças são incuráveis e as terapias

são limitadas à compensação dos sintomas. Ainda assim, se a doença é diagnosticada a

tempo, isto é, dentro dos primeiros dias de vida, a criança com PKU é capaz de ter uma vida

normal com uma dieta livre de fenilalanina.

A incidência desses distúrbios metabólicos gira em torno de 1:10.000 (PKU) e de 1:200.000

(doença da urina do xarope de bordo ou leucinose, MSUD). Em média, 1 em cada 1.000 recém-

nascidos é afetado por uma dessas doenças.

O diagnóstico laboratorial destas doenças é feito através da medida da elevação ou

degradação de substâncias marcadoras, respectivamente, no sangue do recém-nascido. Para

este propósito, o sangue é coletado do calcanhar, em papel de filtro, seco e testado em um

laboratório.

Na Alemanha, o exame de 13 doenças alvo é prescrito pela lei de acordo com o Kinder-

Richtlinie (versão datada de 18 de junho de 2015, última revisão entrou em vigor em 16 de

março de 2018). Nove delas devem ser determinadas por espectrometria de massa em tandem,

incluindo desordens do metabolismo de aminoácidos como fenilcetonúria (PKU) e doença da

urina do xarope de bordo (MSUD), desordens do metabolismo de ácidos graxos (deficiência de

MCAD, deficiência de LCHAD, deficiência de VLCAD), assim como as acidemias orgânicas

como a isovalérica (IVA). A triagem para tirosinemia tipo 1 foi incluída na última revisão do

diretivo.

Com a tecnologia da espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) é possível triar um

amplo espectro de doenças metabólicas em uma única corrida analítica. Esse método permite

a detecção simultânea e confiável de várias moléculas alvo, assim como a determinação de

suas respectivas concentrações. Devido a sua alta seletividade, esta técnica dispensa o uso de

uma coluna de HPLC, permitindo corridas analíticas muito curtas (< 2 min.). Para evitar a

interferência de efeitos de supressão iônica e permitir a quantificação precisa dos analitos, o uso

de padrões marcados isotopicamente é essencial.

Dependendo do tipo de papel de filtro utilizado e do hematócrito da amostra, o volume de

sangue no picote do disco de sangue seco (3.2 mm diâmetro) varia entre 2,2 e 3,3 µL de sangue.

Isto permite apenas uma determinação semi-quantitativa dos analitos, e este método de

triagem não deve ser utilizado como método laboratorial para diagnóstico. A triagem neonatal

por LC-MS/MS deve estar sempre apoiada por diagnósticos confirmatórios baseados em

genética molecular, métodos enzimáticos ou cromatografia.


2.2 Uso pretendido

O kit de reagente da Chromsystems MassChrom® Amino Acids ans Acylcarnitines from dried

blood é uma ferramenta de diagnóstico in vitro para ser utilizada em laboratórios clínicos para a

detecção semi-quantitativa dos seguintes metabólitos:

Aminoácidos e metabólitos da tirosina

alanina (Ala), arginina (Arg), ácido aspártico (Asp), citrulina (Cit), ácido glutâmico (Glu), glicina

(Gly), leucina (Leu), metionina (Met), ornitina (Orn), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), tirosina (Tyr),

valina (Val), succinilacetona (SucA)

Carnitina livre e acilcarnitinas

carnitina livre (C0), acetilcarnitina (C2), propionilcarnitina (C3), butirilcarnitina (C4),

isovalerilcarnitina (C5), glutarilcarnitina (C5DC), hexanoilcarnitina (C6), octanoilcarnitina (C8),

decanoilcarnitina (C10), dodecanoilcarnitina (C12), tetradecanoilcarnitina (C14),

hexadecanoilcarnitina (C16) e octadecanoilcarnitina (C18)

As amostras de sangue do calcanhar de recém-nascidos secas em papel filtro são analisadas

por cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massas (LC-MS/MS). O teste é indicado

como uma metodologia de triagem para a detecção precoce de desordens de amino ácidos

e metabolismos de ácidos graxos.

Um método de diagnóstico deve ser usado para confirmação da presunção de perfis anormais

de aminoácidos, succinilacetona e metabolismo de ácidos graxos.

2.3 Princípio do kit de reagentes

Este kit de reagentes Chromsystems foi desenvolvido para a determinação semi-quantitativa,

simples e rápida, de aminoácidos, acilcarnitinas e succinilacetona em spots de sangue seco

para triagem neonatal de distúrbios do metabolismo dos ácidos graxos e aminoácidos pela

espectrometria de massa em tandem.

O preparo da amostra é baseado numa extração eficiente dos analitos do papel de filtro

seguido pela derivatização dos analitos a ésteres butíricos. Para garantir uma quantificação

reprodutível dos analitos, este método utilizado padrão interno estável e marcado

isotopicamente (deuterado) para a calibração e quantificação.

Para a quantificação de succinilacetona, o spot de sangue é extraído uma segunda vez usando

o padrão interno para succinilacetona (material requerido separadamente). Ele contém um

agente especial de derivatização que forma a hidrazona da succinilacetona (Fig. 3) assim,

tornando a análise possível. Esse derivado hidrazona é muito mais fácil de ionizar aumentando a

intensidade do sinal e a confiabilidade da análise. Um padrão interno isotopicamente marcado

é usado novamente. Após a derivatização e extração da succinilacetona, ambos os

sobrenadantes são combinados, todos os analitos convertidos em seus ácidos butíricos e

medidos em uma corrida analítica.

Figura 1: Derivatização da fenilalanina a éster butírico de fenilalanina

OH

O

NH2

+ HOHCl / 60 °C

-H2OO

O

NH2


Figura 2: Derivatização de acilcarnitinas a éster butírico de acilcarnitina R = cadeia alquil (ex. R = CH3 para acetilcarnitina)

Figura 3: Derivatização da succinilacetona em hidrazona de succinilacetona seguindo a formação do éster butírico correspondente

Este kit é uma ferramenta médica de diagnóstico in vitro.

Este kit é um método de triagem, os resultados podem variar dependendo do sistema MS/MS

usado e devem ser analisados em relação a outros dados laboratoriais. A interpretação

clínica dos resultados obtidos com este kit deve ser feita apenas por profissional médico

capacitado e habilitado ou um especialista em metabolismo. Não existem estudos clínicos

sistemáticos sobre a frequência de resultados falso-positivos ou falso-negativos.

(CH3)3N+

O

O

R

OHO

HO+HCl / 60 °C

-H2O

(CH3)3N+

O

O

R

OO

O O

O

OH

N N

O

OH

N N

O

OHO+HCl/60°C

-H2O


3 Sistema LC-MS/MS

Atenção:

Ao utilizar os reagentes, favor verificar as informações de segurança contidas no Apêndice I.

3.1 Parâmetros do equipamento

A análise de aminoácidos, acilcarnitinas e carnitina livre requer um sistema composto por uma

bomba de HPLC, um injetor e um espectrômetro de massa em tandem com sensibilidade

adequada. Para prevenir variações na composição da fase móvel, o frasco que a contém

deverá ser mantido fechado, mesmo durante a operação. Nenhuma coluna de HPLC ou forno

para coluna é necessário. Para conectar o sistema de HPLC ao sistema MS/MS, é necessário um

capilar de restrição (artigo 55015) com pré-filtro em PEEK (artigo 55033 e 15010).

Ajustes do instrumento:

Amostrador automático: Volume de injeção 10 µL

Tempo de corrida: 1,8 min

Gradiente de fluxo: 20 a 600 µL/min

Solução de lavagem para agulha do injetor: Solução de lavagem (artigo 55007)

Perfil do Gradiente:

A robustez do perfil do gradiente depende fortemente da otimização do fluxo do gradiente

relacionado a configuração do instrumento usado.

Devido aos diferentes volumes mortos dos sistemas de HPLC individuais e ao cumprimento do

capilar de restrição, o perfil do gradiente descrito deve ser otimizado para se obter um

cromatograma como mostrado na figura 4. O perfil do gradiente destina-se apenas de base

para a otimização do sistema. Um perfil de gradiente não otimizado pode gerar um

cromatograma como mostrado na figura 5. Neste caso é extremamente recomendado repetir o

procedimento de otimização e ajustar o gradiente de fluxi até que o cromatograma obtido na

figura 4 seja obtido.

A janela do tempo de varredura (scan time window) do sistema tandem MS deve ser ajustada

para o período de tempo no qual a intensidade do sinal alcança o nível máximo

(aproximadamente 0,32 a 1,61 min.).

Tabela 1: Perfil do gradiente

Tempo 0 min 0,32 min 0,33 min 1,60 min 1,61 min 1,80 min 1,81 min

Fluxo 200 µl/min 200 µl/min 20 µl/min 20 µl/min 600 µl/min 600 µl/min 200 µl/min

Caso o sistema HPLC seja incapaz de manter um fluxo constante de 20 µL/min, o método pode

ser realizado alternativamente com um fluxo constante de 100 a 150 µL/min. Contudo, o fluxo

constante causa redução da sensibilidade.


Figura 4: Cromatograma usando um gradiente de fluxo otimizado

Figura 5: Cromatograma resultante de um fluxo de gradiente NÂO otimizado

Nota:

Use somente o gradiente de fluxo otimizado. O uso de um gradiente de fluxo não otimizado irá

deteriorar a performance do kit de reagentes.

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

Inte

nsi

tät,

cp

s

1,0e7

0,0

2,0e7

3,0e7

4,0e7

5,0e7

6,0e7

7,0e7

Zeit, min

0,0

0,33

0,86

0,4 0,2 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 0

5,0e7

4,0e7

3,0e7

2,0e7

2,0e7

6,0e7

0

Zeit, min

Inte

nsi

tät.

cp

s


3.2 Métodos de medição MS/MS

Fundamentos do método de medição:

Em um espectrômetro de massa as moléculas são analisadas por sua relação massa e carga

(m/z). Para isso, as moléculas devem ser ionizadas. Na tecnologia LC-MS, a ionização por eletro

nebulização ou electrospray tem demonstrado ser um método brando de geração de íons

moleculares.

O espectrômetro de massa em tandem (MS/MS) contém dois espectrômetros de massa

conectados em série. No primeiro espectrômetro (MS 1), os íons são separados por sua relação

massa e carga. Em seguida, os íons atingem uma célula de colisão, onde são dissociados em

fragmentos induzidos pela colisão com um gás inerte (argônio ou nitrogênio). Logo depois, o

segundo espectrômetro (MS 2) analisa a fragmentação característica, outra vez pela relação

m/z.

Na tecnologia MS/MS, vários métodos de medição têm se mostrado confiáveis para diferentes

padrões de fragmentação.

Varredura de Perdas Neutras (Neutral Loss Scan):

Muitos aminoácidos butilados fragmentam na célula de colisão pela perda do ácido fórmico,

com massa de 102 Daltons (ver figura 6). Durante a determinação dos aminoácidos no modo de

varredura de Perdas Neutras, o primeiro e o segundo espectrômetros de massa estão varrendo

num intervalo de 102 unidades de massa. Isso gera um espectro de massa seletivo para muitos

aminoácidos neutros e ácidos.

Figura 6: Fragmentação do íon do éster butírico de fenilalanina pela eliminação do éster butírico de ácido fórmico (Neutral Loss 102).

Entretanto, nem todos os aminoácidos podem ser detectados por esse modo de varredura. Os

aminoácidos citrulina e ornitina, por exemplo, perdem amônia em adição ao ácido fórmico,

logo, esses aminoácidos devem ser detectados com uma varredura de Perdas Neutras de 119

(102 + 17). Por outro lado, a glicina deve ser analisada com varredura de Perdas Neutras de 56 e

arginina em modo 161.

Nós recomendamos que todos os aminoácidos que não possam ser detectados em varredura

de Perdas Neutras 102, sejam quantificados no modo Monitoramento de Reações Múltiplas

(MRM).

Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM):

No modo MRM, os dois espectrômetros de massa estão estaticamente ajustados para um valor

de massa específico. O MS 1 seleciona a molécula ionizada de interesse, descartando íons com

massas diferentes. Após a fragmentação da molécula na célula de colisão, o MS 2 detecta o

O

O

NH3+

O

O

NH2+

+

222 (m/z) 120 (m/z) Neutral Loss 102


fragmento característico gerado. O modo MRM garante tanto maior seletividade quanto alta

sensibilidade.

Basicamente, todos os analitos podem ser detectados no modo MRM. Sua desvantagem é o

tempo consumido na otimização do sistema MS/MS para cada transição de massa.

Varredura do Íon Precursor (Parent Ion Scan):

As acilcarnitinas butiladas formam um fragmento iônico característico de m/z = 85 na célula de

colisão (ver figura 7). Durante a determinação de acilcarnitinas e carnitina livre na varredura do

Íon Precursor, o MS 2 está estaticamente ajustado para m/z = 85, enquanto o MS 1 realiza

varredura das moléculas ionizadas que deram origem ao fragmento. Isto gera um espectro de

massa muito seletivo para as acilcarnitinas.

Figura 7: Fragmentação de acilcarnitinas butiladas pela perda de fragmento iônico característico m/z = 85 R = cadeia alquílica (p. ex.: R = CH3 para acetilcarnitina)

3.3 Otimizando os MRMs assim como os experimentos de Perda

Neutra e Varredura do Íon Precursor (tuning)

É altamente recomendado verificar a acurácia e a resolução de massa do sistema MS/MS. Se a

acurácia e a resolução de massa estiverem fora das especificações do fabricante do

instrumento, uma nova calibração do espectrômetro de massa é recomendada. A seguir, as

transições MRM do analito assim como experimentos de Perda Neutra e Varredura do Íon

Precursor devem ser ajustados como abaixo:

Otimizando os MRMs:

1. Dilua o Tuning Mix (artigo 55099, 55098) com Fase Móvel (artigo 55001) como apropriado

para o dispositivo específico

2. Injete o Tuning Mix diluído ou infuse diretamente pela bomba de seringa (fluxo de 0,02

ml/min)

3. Use o Scan Q1 (MS Scan) para determinar as posições exatas do sinal máximo das massas

em MS1 (precursor/íon pai) (pelo menos um decimal)

4. Determine as posições exatas do sinal máximo das massas em MS2 (produto/íon filho) pela

varredura do íon produto

5. Otimize os parâmetros individuais para cada transição MRM (ex. energia de colisão)

6. Use as transições MRM otimizadas para otimizar a fonte de íon, especialmente a voltagem

do capilar, a temperatura, e os fluxos de gases.

Varredura do Íon Precursor:

1. Dilua o Tuning Mix (artigo 55099) com Fase Móvel (artigo 55001) como apropriado para o

dispositivo específico

(CH3)3N+

O

O

R

OO

R

O

OH

C4H8N(CH3)3 + ++ H2C+

CH CH

O

OH

Fragment-Ion m/z = 85



ml/min)

3. Use o Scan Q1 (MS Scan) para determinar as posições exatas do sinal máximo das massas

em MS1 (precursor/íon pai), por exemplo da carnitina (m/z 218) (pelo menos um decimal)

4. Use a varredura do íon produto para determinar a posição exata do sinal máximo do

fragmento característico de acilcarnitinas (m/z 85) (pelo menos uma casa decimal)

5. Programe o experimento de varredura do íon precursor de forma que a faixa de medição

desejada (ex. m/z 200 a m/z 500) seja coberta. Use o valor determinado no ponto 4 como

massa MS2.

6. É recomendado determinar os parâmetros individuais (ex. energia de colisão) para analitos

com baixa intensidade na varredura em um experimento separado de MRM (veja acima).

Use estes parâmetros como configurações globais de toda a varredura do íon precursor.

Alternativamente, também é possível, dependendo do instrumento, armazenar faixas de

parâmetros individuais ao invés de valores globais.

Varredura de Perda Neutra:

1. Dilua o Tuning Mix (artigo 55099) com Fase Móvel (artigo 55001) como apropriado para o

dispositivo específico.


ml/min)

3. Programe o experimento de varredura de perda neutra de forma que a faixa de medição

desejada (ex. m/z 140 a m/z 270) seja coberta. Para o valor de perda neutra armazene 102

amu (igual a clivagem do formato de butil) no experimento

4. É recomendado determinar os parâmetros individuais (ex. energia de colisão) para analitos

com baixa intensidade na varredura em um experimento separado de MRM (veja acima).

Use estes parâmetros como configurações globais de toda a varredura de perda neutra.

Alternativamente, também é possível, dependendo do instrumento, armazenar faixas de

parâmetros individuais ao invés de valores globais.

É recomendado ler o manual de operações do sistema LC-MS/MS. Para quaisquer dúvidas

contate o fabricante do instrumento. Um treinamento fornecido pelo fabricante pode ser

requerido conforme necessidade.

3.4 Procedimento inicial

Antes de iniciar uma análise prepare o sistema LC-MS/MS como descrito a seguir:

1. Antes de iniciar uma sequência analítica, as bombas de vácuo do sistema MS/MS devem

estar em operação por no mínimo 8 horas.

2. Limpe o sistema com aproximadamente 10 mL de fase móvel em fluxo de 200 µL/min.

3. Injete repetidamente os controles preparados, até que dois espectros de massa sucessivos

apresentem valores de concentração e intensidade de sinal bem próximos.

4. A corrida analítica pode ser iniciada.

Para o uso apropriado do seu sistema LC-MS/MS, leia o manual do equipamento. Em caso de

quaisquer dúvidas, solicite ao fabricante do dispositivo. Um treinamento no uso do equipamento

com seu fabricante pode ser requerido.

3.5 Desligando o equipamento (Shut down)

Para pausar a operação, desligue a bomba do HPLC e deixe a Fase Móvel no sistema de HPLC.

É improvável que cristais de sal se acumulem nos selos do pistão das bombas de HPLC. As

bombas de vácuo do sistema LC-MS/MS devem permanecer operando o tempo todo. Para

proteger fonte de ionização e a multiplicadora, o sistema MS/MS deverá ser colocado no modo

de repouso (stand-by). Deixe as bombas de vácua do sistema LC-MS/MS ligadas.


4 Transições de massa dos analitos e padrões internos

As tabelas que seguem mostram as transições de massa recomendadas e os métodos de

medição dos analitos derivatizados (butilados) e padrões internos isotopicamente marcados.

Tabela 2: Transições de massa recomendadas, aminoácidos e metabólito da tirosina (SUAC)

Substância Método de medição Transição de massa

Alanina Neutral Loss Scan 102 146 → 44

Alanina-D4 Neutral Loss Scan 102 150 → 48

Ácido Aspártico Neutral Loss Scan 102 246 → 144

Ácido Aspártico-D3 Neutral Loss Scan 102 249 → 147

Ácido Glutâmico Neutral Loss Scan 102 260 → 158

Ácido Glutâmico-D5 Neutral Loss Scan 102 265 → 163

Leucina Neutral Loss Scan 102 188 → 86

Leucina-D3 Neutral Loss Scan 102 191 → 89

Metionina Neutral Loss Scan 102 206 → 104

Metionina-D3 Neutral Loss Scan 102 209 → 107

Fenilalanina Neutral Loss Scan 102 222 → 120

Fenilalanina-D5 Neutral Loss Scan 102 227 → 125

Tirosina Neutral Loss Scan 102 238 → 136

Tirosina-D4 Neutral Loss Scan 102 242 → 140

Valina Neutral Loss Scan 102 174 → 72

Valina-D8 Neutral Loss Scan 102 182 → 80

Arginina MRM 231 → 70

Arginina-D7 MRM 238 → 77

Citrulina MRM 232 → 113

Citrulina-D2 MRM 234 → 115

Glicina MRM 132 → 76

Glicina-¹³C2-¹5N MRM 135 → 79

Ornitina MRM 189 → 70

Ornitina-D6 MRM 195 → 76

Prolina MRM 172 → 116

Prolina-D7 MRM 179 → 123

Succinilacetona MRM 211 → 109

Succinilacetona-¹³C5 MRM 216 → 114


Tabela 3: Transições de massa recomendadas, acilcarnitinas e carnitina livre

Substância Método de medição Transição de massa

Carnitina Parent Ion Scan 85 218 → 85

Carnitina-D9 Parent Ion Scan 85 227 → 85

C2-Carnitina Parent Ion Scan 85 260 → 85

C2-Carnitina-D3 Parent Ion Scan 85 263 → 85







C5DC-Carnitina Parent Ion Scan 85 388 → 85

C5DC-Carnitina-D6 Parent Ion Scan 85 394 → 85















As massas apresentadas são um ponto inicial para otimizações. A posição exata do sinal de

máxima intensidade pode variar para cada sistema MS e tem que ser determinada pelo tuning

(pelo menos uma posição após o ponto decimal), utilizando a Mistura para Tuning (ordem no.

55099 e 55098), que contém todos os analitos e padrões internos.

A quantificação dos analitos é feita pela comparação da intensidade do sinal com o padrão

interno isotopicamente marcado correspondente. Várias acilcarnitinas de interesse diagnóstico,

para as quais os padrões internos isotopicamente marcados ainda não estão disponíveis,

também podem ser medidas com este kit, através da comparação do sinal com padrões

deuterados que apresentem o mesmo comprimento de cadeia. Acilcarnitinas com

comprimento de cadeia igual mostram aproximadamente o mesmo fator de resposta.

Entretanto, este kit é validado somente para aqueles analitos com padrões internos deuterados

disponíveis, descritos na tabela acima.


A tabela seguinte mostra algumas acilcarnitinas adicionais, com seus respectivos valores de

transição de massa e padrões internos isotopicamente marcados recomendados. Tais

informações são apenas uma sugestão, representando a prática corrente de muitos laboratórios

de triagem. O kit de reagentes Chromsystems não é validado para esses analitos.

Tabela 4: Acilcarnitinas adicionais sem padrão interno explícito

Substância Transição de massa Padrões internos recomendados

C3DC-Carnitina 360 → 85 C3-Carnitina-D3

C4OH-Carnitina 304 → 85 C4-Carnitina-D3

C4DC-Carnitina 374 → 85 C4-Carnitina-D3

C5:1-Carnitina 300 → 85 C5-Carnitina-D9








C16:1OH-Carnitina 470 → 85 C16-Carnitina-D3







5 Preparo da amostra

Atenção: Ao utilizar os reagentes, favor verificar as informações de segurança contidas no

Apêndice I.

5.1 Coleta e armazenamento das amostras de pacientes

Para a coleta e armazenamento de amostras de pacientes, diferentes recomendações estão

disponíveis para países diferentes. A aderência a regulações nacionais é extremamente

recomendada. Por exemplo, na Alemanha, a coleta de sangue para a triagem neonatal deve

ser feita entre 48 e 72 horas após o nascimento (ver “Kinder Richtlinie”), enquanto, de acordo

com o Guia NBS01-A6, 2013 do CLSI, “é preferível para a triagem que a amostra seja coletada

após 24 horas do nascimento”.

O sangue é gotejado em um papel de filtro e seco. É recomendado o uso de papel de filtro

aprovado pelo FDA ou equivalente (ex. Whatman 903). A amostra de sangue deve ser coletada

do calcanhar do recém-nascido. Amostras com EDTA ou heparina não devem ser utilizadas pois

podem levar a resultados falso-negativos ou falso-positivos.

Descrição resumida das etapas da coleta:

1. Limpe a área do calcanhar do recém-nascido destinada à punção com antisséptico. Seque

o calcanhar com cotonete estéril.

2. Perfure o calcanhar com uma lanceta estéril. A ponta da lanceta deve ser menor que 2 mm,

pois, perfurações profundas podem ferir crianças pequenas.

3. Descarte a primeira gota de sangue com um cotonete estéril.

4. Colha a próxima grande gota de sangue com o papel de filtro, aguardando até que a

amostra seja adsorvida no papel e preencha totalmente o círculo delimitado. Não aplique

uma gota de sangue sobre a outra e nem colha em ambos os lados do papel, pois isto

altera o volume de sangue coletado por spot e pode produzir falsos resultados patológicos.

5. Preencha cada um dos círculos remanescentes no papel de filtro com uma única gota de

sangue.

6. Cuidados com o local de punção deve estar de acordo com a prática comum do

hospital/laboratório

7. Deixe o sangue coletado secar por 4 horas, repousando o papel de filtro em uma superfície

horizontal, não-absorvente, em temperatura de +20 a +25°C.

8. Envie as amostras secas em papel de filtro para o laboratório dentro de 24 horas.

Para instruções detalhadas da coleta da amostra, consulte o manual do fabricante do papel de

filtro ou as orientações nacionais padronizadas.

O armazenamento em ambiente de baixa umidade (menor que 30%) em temperatura

ambiente (+20 a +25°C) é adequado, se a análise for realizada dentro de 24 a 48 horas. Baixa

umidade e baixas temperaturas (refrigerado ou abaixo de -18°C) são sugeridos para


armazenamento superior a 48 horas [14]. Evite temperaturas acima de 37ºC. Isto pode causar a

diminuição de alguns aminoácidos.

Nota:

É responsabilidade individual dos laboratórios usar todas as referências disponíveis e/ou seus

próprios estudos para determinar critérios específicos de estabilidade.

5.2 Reconstituição do padrão interno

O padrão interno (artigo 55004) é utilizado como padrão de calibração para cada amostra e é

rastreável a substâncias de referência isotopicamente marcadas adquiridas de fornecedor

certificado. Após reconstituição, uma quantidade definida de padrão interno é adicionada a

amostra e, então, submetido a todo o procedimento de preparação das amostras.

Antes do preparo de amostras, reconstitua o Padrão Interno (artigo 55004) com 50 mL do

Tampão de Extração. Faça os seguintes procedimentos:

1. Pipete 5 ml do Tampão de Extração (artigo 55008) no frasco original do Padrão Interno

2. Reconstitua por aproximadamente 5 min entre +20 e +25°C, agite suavemente e

repetidamente

3. Transfira o conteúdo do frasco para um balão volumétrico de 50 ml

4. Enxague o frasco do Padrão Interno duas vezes com 5 ml do Tampão de Extração e transfira

o líquido para o balão volumétrico

5. Complete o volume do balão volumétrico para 50 mL com o Tampão de Extração e

homogeneíze.

Evite a exposição direta à luz. A concentração atual depende do lote e poderá ser encontrada

no folheto de informações que acompanha o padrão.

Estabilidade do Padrão interno reconstituído:

O Padrão Interno reconstituído no Tampão de Extração tem a seguinte estabilidade:

Tabela 5: Estabilidade do Padrão Interno após reconstituição

Temperatura de

armazenamento Estabilidade

Outras condições de

armazenamento

+2 a +8°C 3 semanas Protegidas da luz, bem fechadas

5.3 Manuseio dos controles

Os controles (nível I (artigo 0192) e nível II (artigo 0193), disponíveis na forma de spots de sangue

seco em papel de filtro são submetidos a todo o procedimento de preparação das amostras,

assim como as amostras de pacientes. Os controles assim preparados são incluídos em cada

série analítica para monitorar a exatidão e a precisão do sistema.

A embalagem com fechamento tipo zip contêm o material de controle, envelopes com

dissecante e um cartão indicador de umidade. Verifique as condições do cartão indicador de

umidade a cada vez que a embalagem do controle for aberta. Se o indicador apresentar uma

mudança da cor azul para rosa, em 50%, os controles não devem ser mais usados. Tome

cuidado ao remover o material de controle da embalagem de armazenamento abaixo de -

18°C. Para evitar condensação, a embalagem deve ser mantida em temperatura de +20 a +25°

antes de ser aberta. Imediatamente após o uso, coloque o material de controle remanescente

de volta na embalagem com fechamento tipo zip, feche bem e congele abaixo de -18°C.


Uma fita de registro de temperatura está fixada na embalagem dos controles. Uma mudança

permanente da cor branca para preta indica que a temperatura correspondente no indicador

foi alcançada. Evite temperaturas acima de 37°C. Decréscimo na concentração dos analitos

(aminoácidos) pode ocorrer. Evite exposição direta à luz do solar.

A concentração atual depende do lote e poderá ser encontrada no folheto de informação que

acompanha o controle.

Atenção:

Este produto foi fabricado a partir de pool de sangue total humano testado, fornecendo

resultados negativos para infecções pelo vírus da imunodeficiência (HIV), o vírus da hepatite B

(HBV), o vírus da hepatite C (HCV) e a bactéria Treponema pallidum. Ainda assim, um

potencial risco de infecção não pode ser totalmente excluído. Considerar todos os produtos

contendo material de fonte humana como potencialmente infeccioso e manipulá-lo com o

mesmo cuidado destinado a amostras de pacientes potencialmente infecciosas.

5.4 Procedimento de preparo das amostras

5.4.1 Preparo da amostra sem placa filtrante - somente para amino ácidos e acilcarnitinas

1. Picotagem da amostra:

Faça um picote no papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3.2 mm da amostra de

sangue seco e coloque dentro de um poço da placa de 96 poços.

2. Extração de aminoácidos/acilcarnitinas:

Adicione 200 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2). Sele a placa com a folha

de proteção e agite por 20 minutos a 600 rpm, em +20 a +25°C.

3. Transferência/Evaporação:

Remova a folha de proteção da placa de 96 poços. Transfira o sobrenadante para uma

nova placa de 96 poços. Evapore a 60°C e 600 rpm para secar sobre fluxo de ar.

Importante: Não pode haver umidade remanescente na placa de 96 poços. A umidade

interfere na derivatização.

4. Derivatização (butilação):

Adicione 60 µL do reagente de derivatização. Sele a placa com a folha de proteção e

incube a 60°C e 600 rpm por 15 minutos.

5. Evaporação

Remova a folha de proteção da placa de 96 poços. Evapore a 60°C e 600 rpma para secar

sobre fluxo de ar.

Cuidado: Uma fumaça corrosiva emerge durante a evaporação do reagente de

derivatização! Sempre trabalhe sob exaustor.

6. Reconstituição do eluato

Adicione 100 µl do tampão de reconstituição. Agite a 600 rpm por 1 minuto.

7. Injeção:

Injete 10 µL do eluato no sistema LC-MS/MS.

A precisão e exatidão da análise devem ser monitoradas com a inclusão de controles adicionais

em cada corrida analítica.


5.4.2 Preparo da amostra com placa filtrante - somente para amino ácidos e acilcarnitinas


Coloque uma placa de 96 poços com filtro em uma placa de 96 poços. Faça um picote no

papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3.2 mm da amostra de sangue seco e

coloque dentro de um poço da placa filtrante.

2. Extração:

Adicione 200 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2) em cada disco de papel.

Sele a placa filtrante com a folha de proteção (artigo 55011) e agite ambas as placas por

20 minutos a 600 rpm, em +20 a +25°C.

3. Centrifugação/ Evaporação:

Remova a folha de proteção da placa de 96 poços com filtro. Filtre o sobrenadante para a

placa de 96 poços por centrifugação a 3000 x g por 2 minutos. Descarte a placa filtrante e

evapore o eluato a 60°C e 600 rpm para secar sobre fluxo de ar.

Importante: Não pode haver umidade remanescente na placa de 96 poços. A umidade



Adicione 60 µL do reagente de derivatização. Selar a placa com a folha de proteção e

incubar a 60°C e 600 rpm por 15 minutos.

5. Evaporação

Remova a folha de proteção da placa de 96 poços. Evapore a 60°C e 600 rpma para secar

sobre fluxo de ar.

Cuidado: uma fumaça corrosiva emerge durante a evaporação do reagente de




7. Injeção:

Injete 10 µl do eluato no sistema LC-MS/MS.




5.4.3 Preparo da amostra incluindo succinilacetona


Faça um picote no papel de filtro, de forma a retirar um disco de 3.2 mm da amostra de

sangue seco e coloque dentro de um poço da placa de 96 poços.

2. Extração:

Adicione 200 µL de padrão interno reconstituído (ver capítulo 5.2). Tampe a placa filtrante

com a folha de proteção (artigo 55011) e agite ambas as placas por 20 minutos a 600 rpm,

em +20 a + 25°C.

3. Transferência:

Remova a folha de proteção da placa. Transfira o sobrenadante para uma nova placa de

96 poços.

4. Extração do succinilacetona

Adicione 150 ul de Padrão Interno para succinilacetona (ref. 55044) aos spots de sangue

restantes. Tampe a placa filtrante com a folha de proteção e agite a placas por 30 minutos

a 600 rpm, a 60°C.

Nota: O sobrenadante obtido na etapa 3 pode ser incubado sem a folha protetiva durante a

extração de SUAC encurtando o tempo de evaporação subsequente.

Importante: Assegurar que o sistema mantenha a temperatura de 60°C durante toda a

incubação.

Cuidado: Durante o armazenamento correto a -18°C, o padrão interno para succinilacetona

congela parcialmente. Assegurar que o líquido na garrafa esteja completamente

descongelado e misturado de forma homogênea antes do uso.

5. Transferência / Evaporação:

Remova a folha de proteção da placa de 96 poços. Combine o sobrenadante com o primeiro

sobrenadante em uma nova placa de 96 poços.

Evapore a combinação de sobrenadantes a 60°C e 600 rpm para secar sobre fluxo de ar.

Importante: Cuidado para não secar em excesso as amostras pois isso pode levar a perda de

succinilacetona. Não pode haver umidade remanescente na placa de 96 poços. A umidade



Adicione 60 µL do reagente de derivatização. Selar a placa com a folha de proteção e

incubar a 60°C e 600 rpm por 15 minutos.

Importante: Assegurar que o sistema mantenha a temperatura de 60°C durante toda a

incubação.

7. Evaporação

Remova a folha de proteção da placa de 96 poços. Evapore a 60°C e 600 rpm para secar

sobre fluxo de ar.

Importante: Cuidado para não secar em excesso as amostras pois isso pode levar a perda de

succinilacetona.

Cuidado: Uma fumaça corrosiva emerge durante a evaporação do reagente de





9. Injeção:

Injete 10 µL do eluato no sistema LC-MS/MS.



Atenção:

Use somente os reagentes, placas de 96 poços e folhas de proteção fornecidas no kit.

Variações no preparo das amostras irão alterar a eficiência do kit.

5.5 Estabilidade das amostras

As amostras preparadas para análise como indicado na seção 5.4 possuem a seguinte

estabilidade:

Tabela 6: Estabilidade das amostras preparadas

Temperatura de

armazenamento Estabilidade Outras condições de armazenamento

+20 a +25°C 7 dias Protegidas da luz, frascos de vidro, bem fechadas

+2 a +8°C 14 dias Protegidas da luz, frascos de vidro, bem fechadas

Abaixo de -18°C 3 semanas Protegidas da luz, frascos de vidro, bem fechadas

Amostras descongeladas precisam ser bem homogeneizadas antes da injeção.

6 Materiais requeridos, mas não fornecidos

A determinação de aminoácidos e acilcarnitinas por LC-MS/MS a partir de sangue seco requer os

seguintes materiais adicionais que não são fornecidos no kit de reagentes:

− Espectrômetro de massa em tandem com software de avaliação;

− Sistema de HPLC com bomba, injetor e amostrador automático;

− Picotador automático ou manual, para picotar as amostras, 3.2 mm em diâmetro;

− Agitador termoestável para placas de 96 poços para extração e derivatização das

amostras, ex. Thermo Shaker PST-60HL-4;

− Ventilador de ar quente para evaporação das amostras;

− Presilhas de borracha (elástico) para prender as folhas de proteção às placas de 96

poços;

− Pipeta ou pipeta multicanal, 60-200 µL;

− Ponteiras;

− Exaustor;

− Balão volumétrico com capacidade para 50 mL;

− Papel de filtro para coleta de amostras de sangue do calcanhar.

7 Resultados e avaliação

O padrão interno é utilizado como um calibrador individual para cada amostra, reduzindo assim

os efeitos de matriz ao mínimo. Para este fim, a amostra (controle, paciente) é misturada com

uma quantidade definida de padrão interno. As concentrações dos compostos isotopicamente


marcados no padrão interno dependem do lote e serão encontradas nos folhetos informativos

que acompanham os padrões.

O volume de sangue utilizado é fundamental para a quantificação bem-sucedida das amostras.

O volume de sangue obtido através do picote de um disco de sangue seco depende do

diâmetro do disco picotado, do hematócrito da amostra e do material do papel de filtro

utilizado.

O Guia NBS01-A6 [14] do CLSI fornece a recomendação que somente papel de filtro que é

pretendido para análise em spot de sangue seco deve ser usado para triagem neonatal. Alguns

papeis de filtro comerciais estão disponíveis, ex. Whatman 903 (GE Healthcare) que preenchem

os requisitos do Guia NBS01-A6, 2013, do CLSI, Apêndice C. A punção usada deve ser de 1/8

polegada (aprox. 3.2 mm de diâmetro). O volume de sangue depende do valor do hematócrito.

O Guia NBS01-A6, 2013, do CLSI usa sangue de doador que teve o valor de hematócrito

ajustado a 0.55, e o CDC usa sangue de doador com valor de hematócrito de 0.50 [15].

Dependendo do valor do hematócrito, o volume de sangue varia levemente entre 3.4 µl para

um hematócrito de 0.55 e 3.1 µl para um hematócrito de 0.45.

Uma vez que o volume de sangue varia de amostra para amostra, este procedimento de

triagem é método de determinação semi-quantitativo. Para confirmar resultados de triagem

positivos, testes diagnósticos adicionais devem ser realizados.

Antes de iniciar a análise quantitativa de amostras de pacientes, é recomendado realizar vários

testes de corrida. Para este propósito, injete os controles preparados repetidamente, até que

dois sucessivos espectros de massa apresentem valores de concentração e de intensidade de

sinal quase idênticos.

Dependendo do software utilizado, os valores dos componentes do padrão interno e o volume

de sangue ou a concentração do padrão interno relacionada à amostra é necessária. Entre

com as concentrações (ver folheto informativo) do padrão interno na tabela de análise.

Se qualquer outro tamanho de perfuração do sangue seco for utilizado (volume da amostra),

as concentrações de amostras relacionadas ao padrão interno devem ser corrigidas.

Para assegurar que as condições do LC-MS/MS não sofreram variações durante a corrida

analítica, os controles preparados devem ser injetados durante a corrida e novamente ao final.

Para o manuseio correto do software, entre em contato com o fabricante, se necessário. Notas

de cálculo manual podem ser encontradas no Apêndice II.

8 Controle de Qualidade

Precisão e acurácia das análises podem ser monitoradas pela inclusão de controles adicionais

em cada corrida analítica (Spots de sangue seco da Chromsystems, artigos 0192, 0193).

9 Valores de Cut-off / referência

Estes valores de cut-off possuem somente propósito de orientação e podem variar dependendo

do grupo de paciente e do sistema MS/MS usado. Cada laboratório de triagem deve determinar

seus próprios valores de cut-off em um estudo piloto em consulta com um especialista em

metabolismo.


Tabela 7: Valores de cut-off, aminoácidos e metabólito de tirosina (SUAC)

Analito Cut-off [a] Cut-off [b]

Alanina 743 µmol/l 561 µmol/l

Arginina 35 µmol/l 47 µmol/l

Ácido Aspártico 270 µmol/l 147 µmol/l

Citrulina 33 µmol/l 34 µmol/l

Ácido Glutâmico 710 µmol/l 800 µmol/l

Glicina 717 µmol/l 834 µmol/l

Leucina 270 µmol/l 226 µmol/l

Metionina 22 µmol/l 45 µmol/l

Ornitina 350 µmol/l 258 µmol/l

Fenilalanina 92 µmol/l 92 µmol/l

Prolina ---- 441 µmol/l

Tirosina 225 µmol/l 197 µmol/l

Valina 198 µmol/l 191 µmol/l

Succinilacetona ---- 1,16 µmol/l

Tabela 8: Valores de cut-off, acilcarnitinas e carnitina livre

Analito Cut-off [a] Cut-off [b]

C0-Carnitina 60,3 µmol/l 49,8 µmol/l

C0, cutoff baixo 5,2 µmol/l 8,0 µmol/l





C5DC-Carnitina 0,34 µmol/l 0,22 µmol/l








[a] Valores de cut-off dados como percentil 99.5% foram determinados em um estudo piloto com

aproximadamente 1.500 bebês recém-nascidos realizado no centro de triagem do Hospital Universitário de

Lepzig usando o kit de reagentes 55000.

[b] Valores de cut-off dados como percentil 99.5% foram determinados em um estudo piloto com

aproximadamente 2.500 bebês recém-nascidos realizado na Universidade Médica de Viena,

Departamento de Pediatria e Medicina para Adolescentes, usando o kit de reagentes 55000.


10 Fatores de conversão

As tabelas seguintes listam os fatores de conversão entre massa e concentração molar e vice-

versa.

Tabela 9: Fatores de conversão, aminoácidos e metabólito da tirosina (SUAC)

Analito mg/l em µmol/l µmol/l em mg/l

Alanina x 11,223 x 0,0891

Arginina x 5,7405 x 0,1742

Ácido Aspártico x 7,5126 x 0,1331

Citrulina x 5,7081 x 0,1752

Ácido Glutâmico x 6,7967 x 0,1471

Glicina x 13,321 x 0,0751

Leucina x 7,6237 x 0,1312

Metionina x 6,7020 x 0,1492

Ornitina x 7,5666 x 0,1322

Fenilalanina x 6,0536 x 0,1652

Prolina x 8,6858 x 0,1151

Tirosina x 5,5191 x 0,1812

Valina x 8,5361 x 0,1172

Succinilacetona x 6,3231 x 0,1581

Tabela 10: Fatores de conversão, acilcarnitinas e carnitina livre

Analito mg/l em µmol/l µmol/l em mg/l

C0-Carnitina x 6,2019 x 0,1612





C5DC-Carnitina x 3,6319 x 0,2753



C10-Carnitina x 3,1701 x 0,3154

C12-Carnitina x 2,9109 x 0,3435

C14-Carnitina x 2,6915 x 0,3715

C16-Carnitina x 2,5023 x 0,3996

C18-Carnitina x 2,3384 x 0,4276


11 Armazenamento e estabilidade dos reagentes

Fechados, e desde que as condições de transporte e armazenamento sejam cumpridas, os

reagentes são estáveis até a data de validade determinada no rótulo. Transporte e armazene os

reagentes sob as seguintes condições:

Tabela 11: Condições de transporte para os kits de reagente e conjunto de upgrade

Produto Temperatura de transporte

Kit de Reagentes (artigo 55000, 55000/F) +18 a +30°C

Conjunto de Upgrade Succinilacetona (artigo

55111) +18 a +30°C

Imediatamente após o transporte, desempacote os reagentes e armazene individualmente

como determinado abaixo:

Tabela 12: Condições de armazenamento dos reagentes

Produto Condição

Fase móvel (art. 55001) +18 a +30°C

Solução de limpeza (art. 55007) +18 a +30°C

Tampão de extração (art. 55008) +18 a +30°C

Reagente de derivatização (art. 55005) +18 a +30°C

Tampão reconstituição (art. 55006) +18 a +30°C

Placa de 96 poços (art. 55010) +18 a +30°C

Tuning Mix (art. 55099) +2 a +8°C

Padrão Interno (art. 55004) Abaixo de -18°C

Controles nível I e nível II, DBS (arts. 0191, 0192, 0193) Abaixo de -18°C

Padrão Interno para succinilacetona (art. 55044) Abaixo de -18°C

Tuning Mix para succinilacetona (art. 55098) +2 a +8°C

Os reagentes devem ser fechados e armazenados nas condições estabelecidas tão logo sejam

utilizados. Se nada tiver sido previamente determinado, a validade de um reagente em uso

deverá ser de 1 ano após sua abertura, não excedendo o seu respectivo prazo de validade.

Para calibradores e controles, ver os capítulos 5.2 e 5.3 deste manual.


12 Descarte de Resíduos

A Fase Móvel, Solução de Lavagem, Tampão de Extração, Padrão Interno para succinilacetona,

Tampão de Reconstituição e as soluções de Tuning Mix contêm solventes orgânicos. Descarte os

resíduos destes produtos em um recipiente para solventes orgânicos livres de halogênio.

O Reagente de Derivatização contém solventes orgânicos e halogênios. Descarte os resíduos

destes produtos em um recipiente para solventes orgânicos contendo halogênio.

Os resíduos de amostras de pacientes e amostras preparadas, assim como os controles, devem

ser coletados e descartados como lixo potencialmente infeccioso.

As soluções mencionadas não devem ser descartadas junto com o lixo doméstico. Não circule

no abastecimento principal de água. Descarte de acordo com a diretiva 2008/98/EC e de

acordo com as exigências locais e nacionais. Os contêineres de lixo devem ser armazenados

apropriadamente e o acesso só deve ser permitido a pessoas autorizadas.


13 Exemplos de espectros de massa

Os gráficos a seguir apresentam vários exemplos de espectros de massa criados usando este

método.

Figura 8: Espectro de um controle na faixa de referência de amino ácidos

Figura 9: Espectro de amostra de paciente com fenilcetonúria (PKU) Concentração do analito: 871 µmol/l fenilalanina (m/z = 222)


Figura 10: Espectro de um controle na faixa de referência de acilcarnitinas

Figura 11: Espetro de uma amostra de paciente com MCADD Concentração do analito: 6.63 µmol/l carnitina-C8 (m/z = 344)


Figura 12: Espectro de uma amostra de paciente com VLCADD Concentração dos analitos: 2.61 µmol/l carnitina-C14; 6.84 µmol/l carnitina-C16; 3.56 µmol/l carnitina-C18

Figura 13: Espectro de uma amostra de paciente com acidemia glutária tipo I (GA I) Concentração do analito: 1.15 µmol/l carnitina C5DC (m/z = 388)


14 Interferentes conhecidos

Favor notar:

− Isoleucina interfere com leucina. A concentração medida na amostra é um somatório

das concentrações dos dois aminoácidos.

− Hidroxiprolina interfere com leucina. O valor padrão da hidroxiprolina é insignificante

comparado ao da leucina. Hidroxiprolina não deve causar qualquer falso aumento da

concentração de leucina durante a análise de rotina.

− Metionina sulfona interfere com tirosina. Metionina sulfona é um produto de degradação

da metionina. A concentração padrão da Metionina em crianças é de

aproximadamente 20 µmol/L e as concentrações máximas esperadas de metionina

sulfona estão dentro dessa faixa. O valor patológico de tirosina é de aproximadamente

300 µmol/L. Desta forma, metionina sulfona não deve causar acréscimos significativos na

concentração de tirosina durante análises de rotina.

− Metionina sulfóxido interfere com metionina. Metionina sulfóxido é um produto da

oxidação da metionina. In vivo, metionina sulfóxido é reduzida novamente a metionina

pela ação da enzima metionina sulfóxido redutase. Logo, em condições in vivo, não

devem existir concentrações patológicas de metionina causadas pelo aumento da

concentração de metionina sulfóxido.

− Asparagina interfere com ornitina. A concentração máxima de asparagina em crianças

é de até 140 µmol/l. Somente concentrações maiores de 300 µmol/l de asparagina

geram uma aumento de 20% na concentração de ornitina. Asparagina não deve causar

nenhum falso aumento nas concentrações de ornitina durante análises de rotina.

− Devido à formação de éster dibutílico, o ácido glutâmico interfere com a carnitina-C2.

Entretanto, os valores padrões de ácido glutâmico em crianças não gera um aumento

significativo da concentração de carnitina-C2. O ácido glutâmico não deve causar

nenhum falso aumento nas concentrações de carnitina-C2 durante análises de rotina.

− Aditivos em materiais plásticos (placas de micro titulação, folhas de proteção) usados na

preparação das amostras, podem interferir consideravelmente com algumas

acilcarnitinas, gerando resultados falso-positivos. Logo, este kit de reagentes da

Chromsystems contém todos os materiais plásticos necessários para a análise,

devidamente testados e classificados como livre de interferentes.

− Em pacientes com dietas parenterais, com substituição de tirosina por acetiltirosina, pode

ocorrer decréscimo na concentração de tirosina. A razão elevada entre as

concentrações de Fenilalanina e Tirosina (Phe/Tyr) pode indicar falsamente

fenilcetonúria, mesmo com a concentração de fenilalanina em valores normais.

− Pacientes em uso de pivalina como antibiótico podem apresentar concentrações

elevadas de C5-Carnitina, devido à formação de pivalilcarnitina (isômero da

isovalerilcarnitina). Embora nenhuma desordem metabólica exista, uma acidemia

isovalérica (IVA) pode ser falsamente indicada.

Para o esclarecimento de quaisquer outras questões envolvendo possíveis interferências, entre

em contato com a assessoria científica da Biosys, através de e-mail ou telefone, ou mande um

e-mail para [email protected].


15 Problemas e Soluções

Tabela 13: Problemas e soluções

Problema Possível causa Solução

Gradiente de fluxo não

está sendo gerado

Bomba do HPLC Checar bomba (vazamentos, ar)

Ar no sistema Degaseificar o sistema de HPLC

(purga)

Fluxo inconstante Checar a bomba

Sinais interferentes Sistema de injeção contaminado Limpar com metanol ou injetar

fase móvel 10 vezes

Frascos do amostrador

automático contaminados

Usar frascos novos ou limpá-los

com metanol

Selos dos frascos Usar outros selos

Perda de sinal Defeito no injetor Checar o injetor

Defeito na bomba Checar a bomba

Sistema MS/MS não está pronto Checar o sistema MS/MS

Diminuição da

sensibilidade

Fonte de íons contaminada Limpe a fonte de íons

Espectrômetro de massa

contaminado

Limpe o espectrômetro de massa

Vazamento na válvula de injeção Checar o injetor

Multiplicadora degradada Substitua à multiplicadora

Sinal com pouca

intensidade

Condições de derivatização não

otimizadas

Checar temperatura e tempo de

derivatização

Etapas de evaporação não

finalizadas

Checar umidade na amostra

Ausência de vácuo Defeito na bomba de vácuo Checar todas as bombas de

vácuo

Vazamento no sistema de vácuo Checar tubulações e conexões

Sem suprimento de gás Defeito no gerador de nitrogênio Checar o gerador de nitrogênio

Defeito no compressor Checar compressor

Cilindro de gás vazio Substituir o cilindro de gás

Pressão do gás inadequada Ajustar a pressão do gás


16 Literatura

1. Richtlinie des Gemeinsamen Bundesausschusses über die Früherkennung von Krankheiten

bei Kindern (Kinder-Richtlinie) in der Fassung vom 18. Juni 2015, zuletzt geändert am 19.

Oktober 2017. BAnz AT 15.03.2018 B2.

2. Roscher AA, Olgemöller B. (2004) Newborn screening for inborn errors of metabolism with

tandem spectrometry in Bavaria, Germany. LaboratoriumsMedizin 28(6): 521–4.

3. Cavedon CT, Bourdoux P, Mertens K, Thi HVV, Herremans N, de Laet C, Goyens P. (2005)

Age-related variations in acylcarnitine and free carnitine concentrations measured by

tandem mass spectrometry. Clin Chem 51(4): 745–52.

4. Chace DH, Adam BW, Smith SJ, Alexander JR, Hillman SL, Hannon WH. (1999) Validation of

accuracy-based amino acid reference materials in dried-blood spots by tandem mass

spectrometry for newborn screening assays. Clin Chem 45(8): 1269–77.

5. Zytkovicz TH, Fitzgerald EF, Marsden D, Larson CA, Shih VE, Johnson DM, Strauss AW,

Comeau AM, Eaton RB, Grady GF. (2001) Tandem mass spectrometric analysis for amino,

organic, and catty acid disorders in newborn dried blood spots: A two-year summary from

the New England Newborn Screening Program. Clin Chem 47(11): 1945–55.

6. Schulze A, Lindner M, Kohlmüller D, Olgemöller K, Mayatepek E, Hoffmann GF. (2003)

Expanded newborn screening for inborn errors of metabolism by electrospray ionization-

tandem mass spectrometry: results, outcome, and implications. Pediatrics 111(6): 1399–

1406.

7. Ceglarek U, Stopsack M, Stach B, Müller P, Näke A, Hübner A, Brügel M, Bührdel P, Kies W,

Gahr M, Thiery J. (2003) Ergebnisse des sächsischen Neugeborenenscreenings 2001. Ärzteb

Sachsen 1: 12–15.

8. Sander J, N. Janzen N. (2000) Fettsäureoxidationsstörungen. Frühdiagnose durch Tandem-

Massenspektrometrie. Pädiatrie hautnah 12(4): 161–7.

9. Gempel K, Bauer MF, Gerbitz KD. (1999) Mitochondriale Erkrankungen. Dtsch Ärztebl 96(47):

A3035–42.

10. Knerr I, Nennstiel-Ratzel U, Röschinger W, Maier EM, Baumkötter J, von Kries R. (2005)

Medium-Chain-Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangel: eine klinisch bedeutsame

Stoffwechselstörung. Dtsch Ärztebl 102(38): A2565–9.

11. Chace DH, Kalas TA, Naylor EW. (2003) Use of tandem mass spectrometry for multianalyte

screening of dried blood specimens from newborns. Clin Chem 49(11): 1797–817.

12. Scott CR. (2006) The genetic tyrosinemias. Am J Med Genet C Semin Med Genet 142C(2):

121–6.

13. Mitsubuchi H, Nakamura K, Matsumoto S, Endo F. (2008) Inborn errors of proline metabolism.

J Nutr 138(10): 2016S–20S.

14. Clinical Laboratory Standards Institute. NBS01-A6, July 2013, Blood Collection on Filter Paper

for Newborn Screening Programs.

15. CDC. Newborn Screening Quality Assurance Program, Annual Summary Report 2015,

volume 33b.


Apêndice I: Informações de Riscos

As seguintes informações devem ser observadas e as medidas de segurança relevantes devem

ser tomadas. Mais informações podem ser obtidas a partir das respectivas fichas de segurança.

Elas estão disponíveis por requisição ou podem ser obtidas no nosso site.

Tabela 14: Declaração de perigo e precaução

Produto/

Símbolos de perigo Risco

Fase móvel (artigo 55001, 55002)

Perigo

H225 Líquido e vapor altamente inflamáveis.

H302+H312+H332 Nocivo por inalação, ingestão e contato com a pele.

H319 Causa sérios danos aos olhos.

P280 Utilizar roupa de proteção, luvas adequadas, proteção nos olhos e na

face.

P210 Manter longe do calor, superfícies quentes, faíscas, chamas abertas ou

outras fontes de ignição. Não fumar.

P241 Usar equipamentos elétricos/de ventilação/iluminação à prova de

explosão.

P243 Tomar medidas de precaução contra descarga estatística.

Solução de Derivatização (artigo 55005)

Perigo

H226 Líquido e vapor inflamáveis.

H302 Perigoso se ingerido.

H315 Causa irritação na pele.


H335-H336 Pode causar irritação respiratória. Pode causar tonteira ou enjoo.




face.

P302+P352 Se em contato com a pele: Lave com bastante sabão e água.

P304+P340 Se inalado: Remova a pessoa para um local com ar fresco e a

mantenha respirando confortavelmente.

P305+P352+P338 Se em contato com os olhos: Lave cautelosamente com

água por vários minutos. Remova lentes de contato, se estiverem presentes e

de fácil manipulação. Continue lavando.

P313 Obter atendimento médico.

Tampão de reconstituição (artigo 57006)

Perigo






P241 Use equipamentos elétricos, de ventilação e de iluminação à prova de

explosão.

P243 Tome medida de precaução contra descarga estática.


face.


Produto/


Solução de lavagem (artigo 57007)

Perigo







explosão.



face.

Tampão de extração (artigo 55008)

Perigo


H301+H311+H331 Tóxico se ingerido, em contato com a pele ou se inalado.

H370 Causa danos aos órgãos.




face.

P301+P310 Se inalado: Ligue imediatamente para um centro de

envenenamento/médico.

P302+P352 Se em contato com a pele: Lave com bastante sabão e água.

P403+P233 Armazene em um local bem ventilado. Mantenha os frascos bem

fechados.

Padrão interno para succinilacetona (artigo 55044)

Perigo







explosão.



face.

Tuning Mix (artigo 57099) e Tuning Mix para succilacetona (artigo 55098)

Perigo







explosão.


Produto/




face.

Esses componentes não são classificados como perigosos de acordo com a legislação da

União Européia:

Padrão Interno (artigo 55004)

Controles MassCheck® em sangue seco (artigos 0191, 0192, 0193)

Apêndice II: Cálculo manual

As concentrações dos analitos nas amostras são calculadas de acordo com o seguinte princípio:

− Intensidade de sinal do analito no espectro da amostra = Sinalanalito

− Intensidade de sinal do padrão interno (ISTD) no espectro

da amostra

= SinalISTD

− Volume de sangue no disco = Volsangue

− Volume de padrão interno adicionado = VolISTD

− Concentração C do padrão interno = CISTD

Calcule a concentração do analito A na amostras (Canalito) como a seguir:

Canalito [µmol/l] = Signalanalito x VolISTD

x CISTD SignalISTD x Volsangue

Apêndice III: Validação

Para verificar a linearidade e validar o método, amostras de sangue foram fortificadas com

quantidades definidas de aminoácidos e acilcarnitinas. Múltiplas alíquotas dessas amostras

foram submetidas ao procedimento de preparo.

IIIa: Preparo sem succinilacetona

Salvo indicação em contrário, a determinação destes dados foi feita em um Waters Micromass

Quattro micro API.


Recuperação:

A recuperação analítica foi determinada a partir do coeficiente angular da curva de

calibração de amostras de sangue fortificadas e soluções padrões diluídas.

Tabela 15: Taxas de recuperação, aminoácidos

Analito Recuperação

Alanina 85 %

Arginina 67 %

Ácido Aspártico 77 %

Citrulina 89 %

Ácido Glutâmico 72 %

Glicina 82 %

Leucina 77 %

Metionina 90 %

Ornitina 69 %

Fenilalanina 86 %

Prolina* 81 %

Tirosina 88 %

Valina 79 %

* a determinação deste dado foi realizada no AB Sciex API 4000TM.

Tabela 16: Taxas de recuperação. Acilcarnitinas e carnitina livre


C0-Carnitina 88 %

C2-Carnitina 84 %

C3-Carnitina 81 %

C4-Carnitina 83 %

C5-Carnitina 88 %

C5DC-Carnitina 82 %

C6-Carnitina 86 %

C8-Carnitina 94 %

C10-Carnitina 87 %

C12-Carnitina 97 %

C14-Carnitina 88 %

C16-Carnitina 89 %

C18-Carnitina 92 %


Linearidade e limite de quantificação

O limite de determinação e a linearidade foram determinados por diluição de um eluato de

amostras de sangue preparada com padrão interno. O método é considerado linear a partir do

limite de quantificação até o limite máximo.

Tabela 17: Limite de quantificação e linearidade, aminoácidos

Analito Limite de quantificação

aproximado** Limite máximo de linearidade

Alanina 15,6 µmol/l 2000 µmol/l


Ácido Aspártico 15,6 µmol/l 2000 µmol/l


Ácido Glutâmico 15,6 µmol/l 2000 µmol/l

Glicina 15,6 µmol/l 2000 µmol/l

Leucina 15,6 µmol/l 2000 µmol/l




Prolina* 4,8 µmol/l 2400 µmol/l

Tirosina 15,6 µmol/l 2000 µmol/l

Valina 15,6 µmol/l 2000 µmol/l

*A determinação deste dado foi realizada no AB Sciex API 4000TM.

**O limite de quantificação depende do sistema LC-MS/MS usado.

Tabela 18: Limite de quantificação e linearidade, acilcarnitinas e carnitina livre


aproximado*

Limite máximo de linearidade

C0-Carnitina 1,6 µmol/l 200 µmol/l





C5DC-Carnitina 0,2 µmol/l 25 µmol/l








*O limite de quantificação depende do sistema LC-MS/MS usado.


Precisão intra-ensaio:

A determinação da precisão intra-ensaio foi realizada em três diferentes concentrações, a partir

da média e coeficiente de variação de múltiplas análises (n=10) de uma mesma amostra.

Tabela 19: Precisão intra-ensaio, aminoácidos, n = 10

Analito Coeficiente de variação (concentração do analito)

Alanina 3,4 % (495 µmol/l) 5,2 % (806 µmol/l)

Arginina 4,9 % (44 µmol/l) 5,6 % (204 µmol/l)

Ácido Aspártico 8,1 % (85 µmol/l) 5,5 % (241 µmol/l)

Citrulina 5,8 % (61 µmol/l) 4,1 % (232 µmol/l)

Ácido Glutâmico 4,9 % (439 µmol/l) 5,6 % (761 µmol/l)

Glicina 3,4 % (411 µmol/l) 6,6 % (1120 µmol/l)

Leucina 3,7 % (246 µmol/l) 5,4 % (511 µmol/l)

Metionina 7,1 % (55 µmol/l) 7,0 % (201 µmol/l)

Ornitina 6,4 % (214 µmol/l) 4,6 % (445 µmol/l)

Fenilalanina 4,3 % (120 µmol/l) 4,6 % (464 µmol/l)

Prolina* 4,9 % (418 µmol/l) 4,5 % (615 µmol/l)

Tirosina 8,6 % (178 µmol/l) 6,4 % (500 µmol/l)

Valina 6,9 % (293 µmol/l) 6,8 % (515 µmol/l)

* a determinação deste analito foi realizada no AB SCIEX API 4000TM

Tabela 20: Precisão intra-ensaio, acilcarnitinas e Carnitina livre, n = 10


C0-Carnitina 6,8 % (53,5 µmol/l) 5,9 % (110 µmol/l)

C2-Carnitina 5,2 % (29,0 µmol/l) 6,3 % (65,7 µmol/l)




C5DC-Carnitina 13,1 % (0,57 µmol/l) 14,7 % (2,14 µmol/l)









Precisão inter-ensaio:

A determinação da precisão inter-ensaio foi realizada em três diferentes concentrações, a partir

da média e coeficiente de variação de múltiplas análises (n=10) de uma mesma amostra, em 10

diferentes séries de testes.

Tabela 21: Precisão inter-ensaio, aminoácidos, n = 100












Prolina* 10,4 % (446 µmol/l) 11,0 % (685 µmol/l)



*a determinação deste analito foi realizada no AB SCIEX API 4000TM

Tabela 22: Precisão inter-ensaio, acilcarnitinas e carnitina livre, n = 100
















IIIb: Preparo incluindo a succinilacetona

A determinação destes dados foi feita em um AB SCIEX API 4000TM.

Recuperação:

A recuperação analítica foi determinada a partir do coeficiente angular da curva de

calibração de amostras de sangue fortificadas e soluções padrões diluídas.

Tabela 23: Taxas de recuperação, aminoácidos e metabólito da tirosina (SUAC)


Alanina 86 %

Arginina 65 %

Ácido Aspártico 79 %

Citrulina 90 %

Ácido Glutâmico 85 %

Glicina 71 %

Leucina 81 %

Metionina 87 %

Ornitina 63 %

Fenilalanina 94 %

Prolina 81 %

Tirosina 91 %

Valina 92 %

Succinilacetona 51 %

Tabela 24: Taxas de recuperação, acilcarnitinas e carnitina livre


C0-Carnitina 76 %

C2-Carnitina 72 %

C3-Carnitina 71 %

C4-Carnitina 70 %

C5-Carnitina 75 %

C5DC-Carnitina 62 %

C6-Carnitina 66 %

C8-Carnitina 71 %

C10-Carnitina 77 %

C12-Carnitina 73 %

C14-Carnitina 64 %

C16-Carnitina 77 %

C18-Carnitina 89 %


Linearidade e limite de quantificação:

O limite de determinação e a linearidade foram determinados por diluição de um eluato de

amostras de sangue preparada com padrão interno. O método é considerado linear a partir do

limite de quantificação até o limite máximo.

Tabela 25: Limite de quantificação e linearidade, aminoácidos e metabólito da tirosina (SUAC)


aproximado* Limite máximo de linearidade

Alanina 4 µmol/l 2100 µmol/l


Ácido Aspártico 4 µmol/l 2000 µmol/l


Ácido Glutâmico 4 µmol/l 2200 µmol/l

Glicina 4 µmol/l 2100 µmol/l

Leucina 4 µmol/l 2500 µmol/l




Prolina 5 µmol/l 2400 µmol/l

Tirosina 4 µmol/l 2000 µmol/l

Valina 4 µmol/l 2500 µmol/l

Succinilacetona 0,5 µmol/l 250 µmol/l


Tabela 26: Limite de quantificação e linearidade, acilcarnitinas e carnitina livre


aproximado* Limite máximo de linearidade






C5DC-Carnitina 0,05 µmol/l 11 µmol/l










Precisão intra-ensaio:

A determinação da precisão intra-ensaio foi realizada em diferentes concentrações, a partir da

média de múltiplas análises (n=10) de uma mesma amostra.

Tabela 27: Precisão intra-ensaio, aminoácidos e metabólito da tirosina (SUAC), n=10












Prolina 6,2 % (507 µmol/l) 6,6 % (780 µmol/l)



Succinilacetona 6,8 % (2,2 µmol/l) 8,3 % (6,2 µmol/l)

Tabela 28: Precisão intra-ensaio, acilcarnitinas e carnitina livre, n = 10
















Precisão inter-ensaio:

A determinação da precisão inter-ensaio foi realizada em duas concentrações, a partir da

média de múltiplas análises (n=10) de uma mesma amostra, em 10 diferentes séries de testes:

Tabela 29: Precisão inter-ensaio, aminoácidos e metabólito da tirosina (SUAC), n = 100












Prolina 7,0 % (500 µmol/l) 8,8 % (882 µmol/l)



Succinilacetona 7,6 % (2,2 µmol/l) 7,4 % (12,9 µmol/l)

Tabela 30: Precisão inter-ensaio, acilcarnitinas e carnitina livre, n = 100
















Apêndice IV: Zertifikat


Apêndice V: Símbolos

Em nossos rótulos, especificações e embalagens, usamos os símbolos da EN ISO 15223-1. O

significado de cada símbolo é apresentado na tabela abaixo:

Tabela 31: Símbolos

Símbolo Significado

Fabricante

Usado por

Número do artigo

Número do lote

Consulte as instruções de uso

Limite superior de temperatura:

Armazenar abaixo de determinada temperatura

Limite de temperatura:

Armazenar dentro de um certo limite de temperatura

Dispositivo de diagnóstico In-vitro

amino acids and acylcarnitines from dried blood/derivatized · 2019-05-27 · a tirosinemia tipo 1...

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