UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAPÁPRÓ REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS DE GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO FARMACÊUTICA

Prof. Dr. Moacir de Azevedo Bentes Monteiro Neto

Discente: Raphaelle Sousa Borges

Teste de Ames:Ensaio de Mutação Reversa Bacteriana.

ENSAIO DE MUTAÇÃO REVERSA BACTERIANA

o Identificar substâncias que causem danos genéticos e que possam evoluir amutações;

o Correlação: carcinogênese e mutagênese;

o Medida das taxas de mutação nos sistemas bacterianos;

o Alguns metabólitos produzidos no corpo (fígado) são de fato agentes mutagênicos;

o As 21 reações enzimáticas que convertem carcinógenos em metabólitos bioativosnão ocorrem em bactérias.

ENSAIO DE MUTAÇÃO REVERSA BACTERIANA

o Células procariotas;

o Avaliação da atividade genotóxica e mutação;

o A correlação não é absoluta (depende da classe química);

o Substâncias cancerígenas não detectadas - mecanismos não genotóxicos ausentesem células bacterianas.

PRINCÍPIO DO MÉTODO

o Células bacterianas auxotróficas (Salmonella typhimurium – mutações no operon his);

o Mutações por deslocamento do quadro de leitura ou substituição de pares de base;

o Novas mutações – reversão;

o Ausência de enzimas de metabolização;

o Enzimas de metabolização (fração S9 – fígado de ratos);

o S9: compostos mutagênicos indiretos e diretos.

Características genéticas das linhagens de Salmonella typhimurium que lhes conferem

maior sensibilidade e versatilidade na detecção de diversos tipos de mutágenos.

FONTE: YOSHIDA, E. Segurança de Fitoquímicos Isolados de Dipteryx Alata Vogel sob o Parâmetro da

Mutagenicidade pelo Teste de Ames. In: UMBUZEIRO, G. A.; VARGAS, V. M. F. Teste de mutagenicidade com

Salmonella typhimurium (teste de Ames) como indicador de carcinogenicidade em potencial para mamíferos, 2003.

Mutação rfa. perda

parcial da barreira de

lipopolissacárides da

parede bacteriana.

pKM101. aumento do

sistema de reparo

passível de erro, cuja

presença aumenta a

mutagênese espontânea

e a induzida

pAQ1. introduzido em

TA102 o plasmídio

multicópia que confere

resistência à

tetraciclina

(antibacteriano), sendo

o marcador de sua

presença.

Parental LT2

Deleção uvrB. Um dos

responsáveis pelo

reparo de excisão,

levando a um maior

número de lesões

reparadas por

mecanismos sujeitos a

erros

PRINCÍPIO DO MÉTODO

o Realizado na presença e na ausência de enzimas de metabolização (S9);

o Incorporação em placas: ágar de superfície + meio mínimo (ausência de his);

o Pré-incubação: mistura incubada com ágar de superfície + placas com meio mínimo;

o Contagem de colônias revertentes.

DESCRIÇÃO DO MÉTODO

o Guia de Orientação para Teste de Produtos Químicos (Guideline For Testing OfChemicals);

o Organização para a Cooperação Econômica e Desenvolvimento (OECD).

PREPARAÇÃO

Bactérias:

o Culturas frescas de bactérias cultivadas até a fase exponencial (109 cel/ml);

o Culturas em fase estacionária não deve ser utilizadas;

o As culturas utilizadas no teste devem conter um título elevado de células viáveis;

o A temperatura recomendada para a cultura é de 37°C.

PREPARAÇÃO

o Cinco cepas devem ser utilizadas;

o Quatro cepas de S. typhimurium (TA1535; TA1537 ou TA97 ou TA97a; TA98; eTA100): viáveis e reprodutíveis em laboratório (par de base GC no local da inversãoprimária);

o Cepa de E. coli WP2 ou S. typhimurium TA102: par de base AT no local da inversãoprimária.

PREPARAÇÃO

1. S. typhimurium TA1535, e

2. S. typhimurium ou TA97a TA1537 ou TA97, e

3. S. typhimurium TA98, e

4. S. typhimurium TA100, e

5. E. coli WP2 uvrA, ou E. coli WP2 uvrA (pKM101), ou S. typhimurium TA102.

PREPARAÇÃO

o Aminoácidos específicos: S. typhimurium (his) e E. coli (trip);

o Contagens de revertentes espontâneas: dados históricos de controle e literatura;

o Ágar mínimo adequado: meio mínimo Vogel-Bonner E e glicose;

o Ágar com histidina e biotina ou triptofano (viabilizar as divisões celulares).

PREPARAÇÃO

Ativação Metabólica:

o As bactérias: presença e ausência de um sistema de ativação metabólica;

o Co-fator suplementado da fração pós-mitocondrial (S9): fígado de roedorestratados com agentes indutores de enzimas (Aroclor 1254 ou fenobarbital + ß-naftoflavona);

o Fração pós-mitocondrial: concentrações de 5 a 30% v/v na mistura S9.

PREPARAÇÃO

o Substâncias sólidas: dissolvidas ou suspensas em solventes ou veículos adequados e,se necessário, diluídas antes da exposição das bactérias;

o Substâncias líquidas: adicionadas diretamente aos sistemas de ensaio e/ou diluídasantes do tratamento.

CONDIÇÕES DO TESTE

Solvente/Veículo:

o Solvente/veículo: não deve reagir com a substância em teste e deverá sercompatível com a sobrevivência das bactérias e a atividade da mistura S9;

o Solventes/veículos desconhecidos: a sua inclusão deve ser apoiada por dados queindiquem a sua compatibilidade;

o Recomendação: priorizar o uso de um solvente/veículo aquoso;

o Teste com substâncias instáveis em água: os solventes orgânicos utilizados devem serlivres de água.

CONDIÇÕES DO TESTE

Concentrações de Exposição:

o Citotoxicidade: redução do número de colônias revertentes ou grau desobrevivência das culturas tratadas (pode ser alterada na presença de sistemas deativação metabólica);

o Insolubilidade: precipitação na mistura final nas condições reais de ensaio eevidenciadas a olho nu (5 mg/placa ou 5 ml/placa).

Controles positivos para ensaios com ativação metabólica:

Substância química e Nº CAS (registro)

9,10-dimetilantraceno [CAS. 781-43-1]

7,12-dimetilbenzantraceno [CAS no. 57-97-6]

Vermelho do Congo [CAS. 573-58-0] (para o método de ativação metabólica redutor)

Benzo (a) pireno [CAS no. 50-32-8]

Ciclofosfamida (mono-hidrato) [CAS. 50-18-0 (CAS no. 6055-19-2)]

2-aminoantraceno [CAS no. 613-13-8]

Controles positivos para ensaios sem ativação metabólica:

Química e CAS No. Cepas

(a) Azida de sódio [CAS no. 26628-22-8] TA1535 e TA100

(b) 2-nitrofluoreno [CAS. 607-57-8] TA98

(c) 9-aminoacridina [CAS no. 90-45-9] ou ICR

191[CAS no. 17070-45-0]

TA1537, TA97a e TA97

(d) Hidroperóxido de cumeno [CAS no. 80-15-9] TA102

(e) Mitomicina C [CAS. 50-07-7] WP2 uvrA e TA102

(f) N-etil-N-nitro-N-nitrosoguanidina [CAS. 70-25-7]

ou 4-nitroquinolina 1-óxido [CAS. 56-57-5]

WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101)

(g) Furilfuramida (AF-2) [CAS no. 3688-53-7] Cepas contendo plasmídeo

PROCEDIMENTO

Processamento da Substância Teste:

Método de incorporação em placas sem ativação metabólica:

0,05 ml ou 0,1 ml das soluções de ensaio;

0,1 ml de cultura bacteriana fresca (contendo aproximadamente 108 células viáveis);

0,5 ml de tampão estéril;

2,0 ml de ágar de superfície.

Os conteúdos de cada tubo são misturados em placas de ágar mínimo e vertidos sobre o ágar de

superfície. O ágar de superfície deve solidificar antes da incubação.

PROCEDIMENTO

Processamento da Substância Teste:

Método de incorporação em placas com ativação metabólica:

0,5 ml de mistura de ativação metabólica com fração pós-mitocondrial;

2,0 mL de ágar de superfície;

Bactérias;

Solução/substância teste.

Os conteúdos de cada tubo são misturados em placas de ágar mínimo e vertidos sobre o ágar de

superfície. O ágar de superfície deve solidificar antes da incubação.

PROCEDIMENTO

Processamento da Substância Teste:

Método de pré-incubação:

0,05 ou 0,1 ml Solução/substância teste

0,1 ml de cepas (aproximadamente 108 células viáveis)

Tampão estéril ou sistema de ativação metabólica (0,5 ml)

2,0 ml de ágar de superfície;

20 minutos ou mais a 30°- 37°C.

PROCEDIMENTO

Incubação:

o Todas as placas de cada ensaio devem ser incubadas a 37°C durante 48-72 horas;

o Após período de incubação: contagem do número de colônias com mutação reversaem cada placa.

DADOS E RELATÓRIO

Processamento dos Resultados:

o Contagem individual das placas;

o Número médio de colônias com mutação reversa por placa;

o Desvio padrão da substância teste;

o Controle positivo e controle negativo (não tratado e/ou solvente).

DADOS E RELATÓRIO

o Resultados ambíguos: devem ser melhor esclarecidos, de preferência commodificação das condições experimentais;

o Resultados negativos: precisam ser confirmados caso-a-caso.

DADOS E RELATÓRIO

Avaliação da Interpretação dos Resultados:

o Resultados Positivos: aumento da concentração ao longo do ensaio e/ou aumento nonúmero de colônias com mutação reversa por placa em pelo menos uma cepa, comou sem ativação metabólica;

o Os resultados positivos indicam que a substância induz mutações pontuais porsubstituição de bases ou deslocamento no quadro de leitura do genoma deSalmonella typhimurium e/ou Escherichia coli.

o Os resultados negativos sugerem que, sob as condições do ensaio, a substânciateste não é mutagênica para as espécies testadas.

DADOS E RELATÓRIO

Relatório:

o Substância Teste;

o Solvente/ Veículo;

o Cepas;

o Condições de Ensaio;

o Resultados;

o Discussão dos Resultados;

o Conclusão.

UMBUZEIRO, G. A.; VARGAS, V. M. F. Teste de mutagenicidade com Salmonella

typhimurium (teste de Ames) como indicador de carcinogenicidade em potencial para

mamíferos. In: RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K. Mutagênese

Ambiental. Canoas: ULBRA, 2003. p. 81-112.

MATERIAIS E MÉTODOS

Material Vegetal:

A planta utilizada foi coletada na Serra do Cipó, Minas Gerais, e identificada peloProf. Dr. Paulo Takeo Sano, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparo do Extrato:

60°C

1 semana

Temp. Amb.

Etanol 96%

Solvente

Evaporado

MATERIAIS E MÉTODOS

Fracionamento do Extrato para Obtenção e Isolamento dos Flavonóides:

Extrato etanólico 96% de P. latipes por permeação em gel;

Coluna utilizando Sephadex LH-20 e metanol (eluente);

Cromatografia em camada delgada comparativa;

Visualização sob luz ultravioleta;

Obtenção de espectros de RMN e espectrometria de massas.

MATERIAIS E MÉTODOS

Diluição das Amostras:

5 mg

7 metilquercetagetina

7 metilquercetagetina-4’-O-ß-D-glicopiranosídeo

Extrato Etanólico Bruto

1 mL

Dimetilsufóxido (DMSO)

MATERIAIS E MÉTODOS

Linhagens Utilizadas:

TA100

TA98

Salmonella typhimurium

Detecta mutágenos causadores da substituição de pares de bases do DNA

Mutação no gene hisG (hisG46) - codifica para a histidina

Ponto para a reversão: GC (troca para AT)

Detecta mutágenos causadores do deslocamento do quadro de leitura

Mutação no gene hisD (hisD3052) - codifica para a histidinol desidrogenase

(direciona a enzima ao citosol)

Ponto para a reversão: oito resíduos repetitivos de GC

MATERIAIS E MÉTODOS

Manutenção e Estoque das Cepas:

Salmonella typhimurium

1,5 mL

- 70°C

Manter as características genéticas inalteradas

0,9 mL de cultura

0,1 mL de DMSOcrioprotetora

MATERIAIS E MÉTODOS

Verificação das Características Genéticas das Cepas:

As características genéticas das cepas de S. typhimurium foram checadas antes do preparopara congelamento;

Verificou-se a dependência de histidina, a presença de mutação rfa, a presença de deleçãouvrB e a presença de plasmídeos de resistência.

MATERIAIS E MÉTODOS

Taxa de Reversão Espontânea:

A frequência de reversão foi observada em cada cepa;

Colônias revertentes prototróficas para a histidina: facilmente visíveis em ágar mínimo glicosado;

Colônias auxotróficas: formam uma fina camada de crescimento (background).

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparo dos Inóculos de S. typhimurium Utilizados no Ensaio:

Cultura estoque congelada

Caldo Nutriente30 mL

37°C12 – 16h

1,2 x 109 bac/mL

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparo da Mistura da Fração Microssomal S9:

Agente indutor enzimático

Fração microssomalS9 (fígado)

Revela se o material testado é mutagênico em sua forma original

ou metabolizado

Mistura S9:Cloreto de MagnésioCloreto de PotássioGlicose-6-fosfatoβ nicotinamidaTampão fosfatoÁgua destilada

Fração S9 + H2O

MATERIAIS E MÉTODOS

Controles:

Negativo: DMSO – solvente das amostras;

Positivo: TA98 – 4-nitrofenilenodiamida dissolvida em DMSO;

TA100 – azida sódica dissolvida em água bidestilada (sem ativação)

2-antramina (com ativação metabólica)

MATERIAIS E MÉTODOS

Ensaios de Mutagenicidade:

Flavonóides+

Extrato etanólico bruto+

Cultura de bactérias+

Top ágar

Flavonóides+

Extrato etanólico bruto+

Cultura de bactérias+

Top ágar+

0,5 mL da mistura S9

Sem ativação

Com ativação

Ágar mínimo glicosadotriplicata

Ágar mínimo glicosadotriplicata

37°C48h

Contagem colônias

revertentes

MATERIAIS E MÉTODOS

Análise Estatística:

Salanal;

ANOVA-teste F

RESULTADOS E DISCUSSÃO

o É um método adequado para demonstrar a exposição de usuários à compostosmutagênicos, que fazem parte da composição química de plantas de uso popular;

o Wall et. Al, 1998: flavonóides (quercetina, 3-metilquercetina) apresentam açãomutagênica sem ativação metabólica e potencialização com ativação metabólica;

Hidroxilas livres no anel B;

Hidroxila livre em C3.

o MacGREGOR e JURD, 1978: flavonóides (quercetina, 3-metilquercetina);

Hidroxilas livres em C3’ e C4’ no anel B;

Hidroxila livre em C3;

Dupla ligação em C2 e C3.

Média de desvio

padrão do número

de revertentes

his+/placa para o

grupo controle e

extrato etanólico

bruto.

Média de desvio padrão

do número de

revertentes his+/placa

para o grupo controle e

7-metilquercetagetina.

Média de desvio

padrão do número de

revertentes his+/placa

para o grupo controle e

7-metilquercetagetina-

4’

Não ocorreu aumento da

frequência de mutantes

revertentes com o aumento

da concentração.

As razões de

mutagenicidade foram

menores que 2.

Ausência de

Atividade

Mutagênica!

CONCLUSÃO

o Os resultados obtidos foram diferentes dos apresentados por Wall et. Al (1998) eMacGREGOR e JURD (1978);

o Os flavonoides testados apresentaram:

Posição metoxilada (não livre);

Posição 6 oxigenada;

7-metilquercetagetina apresenta duas hidroxilas livres em C3’ e C4’.

o Os flavonoides testados neste estudo não apresentaram atividade mutagênica,sugerindo segurança na utilização em humanos.

REFERÊNCIAS

AMBROSIO, J. B. (2012). Avaliação dos Efeitos Citotóxicos, Genotóxicos e Mutagênicos de 2 Classes de AgrotóxicosUtilizados em Cultura de Cana-De-Açúcar no Estado de São Paulo – Brasil. 50-57.

AMES, B.N., MCCANN, J. and YAMASAKI, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with theSalmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

CETESB. Companhia Ambiental do Estado de São Paulo, 1996-2013. Disponível em: www.cetesb.sp.gov.br. Acessoem: 10 de Abril de 2015.

DE ROBERTS, E.D.P.; DE ROBERTS, Jr., E.M.F. Bases da biologia celular e molecular. Rio de Janeiro: Guanabara, 1981.332p.

GATEHOUSE, D., HAWORTH, S., CEBULA, T., GOCKE, E., KIER, L., MATSUSHIMA, T., MELCION, C., NOHMI, T., VENITT,S. and ZEIGER, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312,217-233.

MARON, D.M. and AMES, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113,173-21.

REFERÊNCIAS

MARON, D., KATZENELLENBOGEN, J., and AMES, B.N. (1981). Compatibility of Organic Solvents with theSalmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88, 343-350.

MORTELMANS, K.; ZEIGER, E. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutat. Res. 2009, 455, 29–36.

MOREIRA, R.; SANTOS, L.; VARELLA, S.; VARANDA, E.; VILEGAS, W. (2002). Avaliação da atividade mutagênica doextrato etanólico bruto de Paepalanthus latipes e dos compostos flavonóidicos 7-metoxilados Relacionados. Rev. Bra.Farm., V.12, n.1, p. 11-19.

OECD Guideline for Testing of Chemicals. Bacterial Reverse Mutation Test. Postado: 21st July 1997. Disponível em:www.oecd.org. Acesso em: 10 Abril 2015.

UMBUZEIRO, G. A.; VARGAS, V. M. F. Teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium (teste de Ames) comoindicador de carcinogenicidade em potencial para mamíferos. In: RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K.Mutagênese Ambiental. Canoas: ULBRA, 2003. p. 81-112.

YOSHIDA, E. H. Segurança de Fitoquímicos Isolados de Dipteryx Alata Vogel sob o Parâmetro da Mutagenicidadepelo Teste de Ames. Sorocaba: UNISO, 2014. p. 20-27.

OBRIGADA!