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AMANDA TORRES BORGES
VALIDAÇÃO DE ESPÉCIES DE Centropomus (Centropomidae, Perciformes) DO LITORAL DO
RIO GRANDE DO NORTE ATRAVÉS DE CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA E MOLECULAR
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Sistemática e Evolução da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como parte dos requisitos para obtenção de
título de Mestre em Sistemática e Evolução.
Orientador: Dr. Wagner Franco Molina
NATAL - RN
2015
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Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Borges, Amanda Tôrres.
Validação de espécies de Centropomus (Centropomidae, Perciformes) do litoral do Rio Grande do Norte
através de caracterização citogenética e molecular. / Amanda Tôrres Borges. – Natal, RN, 2015.
66 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de
Pós-Graduação em Sistemática e Evolução.
1. Citogenética de peixes. – Dissertação. 2. Mapeamento cromossômico. – Dissertação. 3. DNAr 16S. –
Dissertação. I. Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 575
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FOLHA DE APROVAÇÃO
AMANDA TORRES BORGES
VALIDAÇÃO DE ESPÉCIES DE Centropomus (Centropomidae, Perciformes) DO LITORAL DO
RIO GRANDE DO NORTE ATRAVÉS DE CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA E MOLECULAR
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Sistemática e Evolução da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como parte dos requisitos para obtenção de
título de Mestre em Sistemática e Evolução.
APROVADA: 28 de Março de 2015.
_____________________________ _____________________________
Prof. Dr. Ricardo de Souza Rosa (UFPB) Prof. Dr. Roberto F. Artoni (UEPG)
_____________________________
Prof. Dr. Wagner Franco Molina
(Orientador - UFRN)
5
“Aos meus pais e familiares,
em especial ao meu
avô José Torres (in memoriam)”
6
Agradecimentos
Ao meu orientador Prof. Dr. Wagner Franco Molina, meu sincero muito obrigada pela
confiança depositada em mim, pela sua indiscutível competência e por toda a compreensão
nos momentos difíceis.
Ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução, na qual fui participante e
viabilizou o meu curso de mestrado. Agradeço também a Gisele, secretaria do PPGSE, por
toda dedicação e auxílio nos momentos que foram precisos.
Agradeço a Companhia de Águas e Esgoto do Rio Grande do Norte (CAERN), pelo
crescente incentivo ao aperfeiçoamento do seu corpo técnico, o qual viabilizou, segundo seu
acordo coletivo, os horários de aula durante esse período, assim como as coletas na Lagoa
do Jiqui, através da área da Estação de Tratamento de Água do Jiqui (ETA- Jiqui).
Não poderei aqui deixar de agradecer à Prof. Dra. Lucymara pelo lindo projeto de
extensão Interação Ciência e Educação, que faz parte da Rede Nacional de Educação e
Ciências: Novos Talentos da Rede Pública, criado pelo já falecido Doutor Leopoldo de Meis.
Projeto no qual visa o exercício dos métodos científicos em alunos e professores de escola
pública do RN e a inserção destes na vivência das Universidades Brasileiras. Através do qual
tive a oportunidade de conhecer a área da Citogenética de Peixes Marinhos que me encanta
até hoje.
A todos os amigos e companheiros de Laboratório, Gideão Wagner, Paulo Augusto,
Alysson Sousa, Clóvis Motta, Leonardo Calado, Inailson Cunha, Maria Aparecida, Juliana
Galvão, Karlla Daniele, Rafael Soares, Jeanne e Josi, meu muito obrigado pelas risadas,
conversas, ajuda e acima de tudo pela amizade construída ao longo desses anos, sem vocês
a vida de mestranda seria muito mais difícil.
A Protázio, Prof. Dr. Fúlvio e a Heriberto pela viabilidade das coletas na Lagoa do Jiqui,
CTA-UFRN e Arês, respectivamente.
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Aos meus amigos de graduação, pela amizade e companheirismo, os quais sempre
torço pelo sucesso e sei que sempre torceram pelo meu sucesso, deixo meu abraço a cada
um e principalmente a Juh, Frivi, Alê, Sylp, Pg, Sávio, Tábata, Ju Galvão, Julia, Fernando e Jp.
Companheiros CAERNianos, com os quais eu me orgulho em trabalhar e sei que estão
orgulhosos por mim. Jay, Nay, Luiz e Bella, obrigada pela amizade, compreensão e ombro
amigo sempre, Jacques e Wagner, meus queridos chefes, obrigada pela confiança e saibam
que foram muito importantes nessa caminhada.
Ao meu avô, José Torres, sei que onde estiver estarás feliz por mim, irei te amar para
sempre.
Aos meus pais, João e Ana, a quem eu dedicado as minhas conquistas e os quais,
apesar das dificuldades, viram no estudo de seus filhos a prioridade de suas vidas, amo
vocês. Além dos meus irmãos, guerreiros, vencedores na vida, Júnior e Jean, vocês foram
meus exemplos. Meu avô e minhas avós, tios e tias, primos e primas, cunhadas e agregados
da família Torres Borges, muito obrigado pela força sempre.
Família Xavier! Muito obrigado pelo carinho e receptividade, em especial a Josenaide e
Francisco Canindé, pela atenção, carinho e apoio nesses dois anos.
À Rodrigo Xavier, para muitos Pantera, você foi a pessoa mais importante nessa
jornada, meu companheiro de coleta, quem aguentou meus desesperos, quem me deu
forças sempre e esteve comigo em cada etapa, obrigada pela dedicação, amo você.
E, por fim, agradeço a Ele, a Deus, pelas bênçãos, pela força, proteção e a quem eu
devo toda minha vida e todas as minhas conquistas.
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“A persistência é o menor
caminho do êxito”.
(Charles Chaplin)
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Resumo
A família Centropomidae é composta por três gêneros, Centropomus, Lates e Psammoperca.
Centropomus é o grupo mais diversificado, apresentando seis espécies com ocorrência no
Oceano Atlântico Ocidental, C. undecimalis (Bloch, 1792), C. poeyi Chávez, 1961, C. parallelus
Poey, 1860, C. mexicanus Bocourt, 1868, C. pectinatus Poey, 1860 e C. ensiferus Poey, 1860.
Algumas destas espécies são consideradas crípticas, por apresentarem características
morfológicas pouco resolutivas para fins de identificação. Apesar do grande interesse como
recurso natural e para cultivo, aspectos sobre sua diversidade e padrões cariotípicos são
pouco conhecidos. Neste trabalho classificações morfológicas e comparações de sequências
mitocondriais 16S foram utilizadas para identificação das espécies do gênero Centropomus
com ocorrência no Rio Grande do Norte, nordeste do Brasil. Duas espécies foram
identificadas, C. undecimalis e C. mexicanus, que tiveram seus aspectos cromossômicos
analisados através de métodos citogenéticos clássicos (coloração convencional, bandamento
C, Ag-RONs), coloração com fluorocromos AT- e GC-específicos, bandas de replicação pela
incorporação do análogo de base 5´BrdU ( 5-bromo-2´-deoxiuridina) e mapeamento
cromossômico in situ de sequências (TTAGGG)n e dos genes RNAr 18S e 5S. Ambas as
espécies apresentaram 2n=48 cromossomos acrocêntricos, com sítios ribossomais (Ag-
RON/DNAr 18S/Mitramicina+) no segundo par cromossômico, em posição telomérica no
braço longo de C. mexicanus) e intersticial em C. undecimalis. O par organizador nucleolar
(par 2) se mostra um marcador citotaxonômico resolutivo para estas duas espécies. Os
dados gerados revelam uma menor diversidade de espécies de Centropomus do que se
acreditava, sugerindo uma maior atenção na identificação taxonômica das espécies, tendo
em vista otimizar ações de exploração comercial, conservação biológica e cultivo.
Palavras chaves: Citogenética de peixes. DNAr 16S. Mapeamento cromossômico.
Hibridização in situ. Robalo.
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Abstract
The Centropomidae family consists of three genera, Centropomus, Lates and Psammoperca.
Centropomus is the most diverse group, with six Centropomus species occur in the Western Atlantic
Ocean C. poeyi Chávez, 1961, C. parallelus Poey, 1860, C. mexicanus Bocourt, 1868, C.
pectinatus Poey, 1860 and C. ensiferus Poey, 1860. Some of these species are considered
cryptic, because of its morphological traits showed low resolution for identification
purposes. Despite showing great interest as a natural resource and fish culture, aspects of
their diversity and karyotypic patterns are poorly understood. In this work morphological
identification and comparison of mitochondrial 16S gene sequence were used to identify the
species of the genus Centropomus occurring in Rio Grande do Norte, northeastern Brazil.
Two sepecies were identified, C. undecimalis and C. mexicanus, which had the chromosomal
aspects analyzed, through Classical cytogenetic method analyzes (conventional staining, C-
banding, Ag-NORs), fluorochrome staining AT- and GC-specific, replication bands by
incorporating of the base analog 5-Bromo-2’-deoxyuridine (5-BrdU), in situ chromosomal
mapping of (TTAGGG)n sequences and in situ chromosome mapping 18S and 5S rRNA genes.
Both species show 2n=48 acrocentric chromosomes, with ribosomal sites (Ag-NOR/18S
rDNA/ Mitramycin+) in second chromosomal pair, in telomeric position on the long arm in C.
mexicanus and interstitial in C. undecimalis. The nuclear organization pair (pair 2) shown a
resolutive cytotaxonomic marker for these two species. The generated data reveal a lower
species diversity than previously believed, suggesting that greater attention should be paid
in taxonomic identification of the species, in view of optimize commercial actions
exploitation, biological conservation and cultivation.
Keywords: Fish cytogenetics. rDNA 16S. Chromosomal mapping. In situ hybridization. Snook.
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Lista de Figuras
Figura 1 - Relações filogenéticas das espécies de Centropomus baseada no gene 16S
(modificada de Tringali et al., 1999). Em destaque as espécies de ocorrência no litoral
brasileiro .................................................................................................................................14
Figura 2. Áreas de distribuição das espécies Centropomus undecimalis e C. mexicanus no
Atlântico. Locais de coleta dos espécimes no litoral do Estado do Rio Grande do Norte (RN).
(a) Extremoz, RN (5°41'05,9"S 35°14'26,5"O); (b) Lagoa do Jiqui – Parnamirim, RN
(5°55'07,5"S 35°11'17,1"O); e (c) município de Arês (6°12'00,0"S 35°09'14,4"O) ..................21
Figura 3. Áreas de coleta dos exemplares de Centropomus ao longo do litoral do Rio Grande
do Norte (RN). (a) Estuário do Rio Ceará-Mirim, Extremoz-RN, (b) Lagoa do Jiqui, Parnamirim-
RN (Bacia do Rio Pitimbu), (c) Estuário do Rio Jacu, Município de Arês .................................32
Figura 4. Exemplares das espécies Centropomus undecimalis (acima) e C. mexicanus (abaixo),
identificados por perfis genéticos do DNAmt 16S em diferentes pontos do litoral do Rio
Grande do Norte. Barra: 5cm .................................................................................................34
Figura 5. Árvore gerada pelo método de Neighbor-Joining baseado em sequências parciais
do gene mitocondrial 16S de indivíduos de Centropomus. Em destaque o agrupamento
contendo exemplares de C. undecimalis (destaque em laranja) das três localidades
amostradas. Clado composto por espécimes com identidade com a espécies C. mexicanus
(caixa em azul). Valores de bootstrap (10.000 replicações) são mostrados nos ramos. Em
parênteses estão os números de acesso no GenBank de sequências para diferentes espécies
de Centropomus .....................................................................................................................35
Figura 6. Cariótipos de Centropomus undecimalis (a, c, e, g), C. mexicanus (b, d, f, h), com
coloração convencional (a, b) e bandamento C (c, d). Padrões de bandas de replicação inicial
(e, f). Os quadros destacam a correspondência nos pares organizadores de nucléolos dos
sítios Ag-RONs e regiões MM+/DAPI-. Barra = 5µm. Sítios de DNAr 18S (vermelho) e 5S
(verde) identificados por dual-color FISH (g, h) ......................................................................50
Figura 7. Mapeamento de sequências (TTAGGG)n em metáfases de Centropomus undecimalis
(CUN) (a) e C. mexicanus (CM)(b). Em (c), ideograma do evento de inversão paracêntrica na
divergência evolutiva no par organizador nucleolar das duas espécies .................................51
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Lista de Tabelas
Tabela 1. Dados merísticos dos espécimes de Centropomus coletados em diferentes pontos
do litoral do Rio Grande do Norte e identificados a partir de dados morfométricos..............36
Tabela 2. Estimativa da divergência genética entre sequências do gene mitocondrial 16S
(584 pares de bases) de Centropomus. Acima diagonal: Desvio padrão. Abaixo diagonal:
divergência genética entre as sequências. As análises foram conduzidas utilizando distância p
e os gaps considerados como deleção par-a-par. Em parênteses encontram-se os números
de acesso do GenBank. CUN – C. undecimalis; CP – C. pectinatus; CPA – C. parallelus; e CM –
C. mexicanus; Jiqui – Lagoa do Jiqui; Arês – estuário do Rio Jacu; Extremoz – Estuário do Rio
Ceará-Mirim ............................................................................................................................37
Quadro 1. Identificação taxonômica comparativa dos espécimes de Centropomus, através de
dados morfológicos e moleculares .........................................................................................38
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Sumário
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 12
1.1. Aspectos biológicos e taxonômicos do gênero Centropomus ......................................... 12 3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................................... 19
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................... 19
4.1. MATERIAL ......................................................................................................................... 19 4.2. OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS MITÓTICOS E ANÁLISES CITOGENÉTICAS .................... 21
4.2.1. Detecção de regiões organizadoras de nucléolos ..................................................... 22
4.2.2. Detecção da heterocromatina constitutiva .............................................................. 23
4.2.3. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos ............................................... 23
4.2.4. Incorporação do análogo de base 5’BrdU ................................................................. 24
4.3. MAPEAMENTO IN SITU DE REGIÕES (TTAGGG)n .............................................................. 24 4.4. HIBRIDAÇÃO FLUORESCENTE IN SITU (FISH).................................................................... 25
4.4.1. Obtenção de sondas .................................................................................................. 25
4.4.2. Hibridização ............................................................................................................... 25
4.5. OBTENÇÃO DE SEQUÊNCIAS MITOCONDRIAIS 16S ......................................................... 26 5. CAPÍTULO 1 ............................................................................................................................. 27
Incongruências entre caracteres morfológicos e moleculares (DNAmt 16S) na identificação
taxonômica de espécies do gênero Centropomus (Perciformes) ............................................... 27
Resumo ................................................................................................................................... 27 Introdução ............................................................................................................................... 28 Material e Métodos ................................................................................................................ 30 Resultados ............................................................................................................................... 32 Discussão ................................................................................................................................. 38 Referências.............................................................................................................................. 40
6. CAPÍTULO 2 ............................................................................................................................. 46
Padrões citogenéticos e marcadores citotaxonômicos em duas espécies de Centropomus da costa
nordeste do Brasil ....................................................................................................................... 46
Resumo ................................................................................................................................... 46 Introdução ............................................................................................................................... 47 Material e Métodos ................................................................................................................ 48 Resultados ............................................................................................................................... 49 Discussão ................................................................................................................................. 51 Referências.............................................................................................................................. 54
Referências Introdutórias ........................................................................................................... 59
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1. INTRODUÇÃO
1.1. ASPECTOS BIOLÓGICOS E TAXONÔMICOS DO GÊNERO CENTROPOMUS
A família Centropomidae é dividida em três gêneros, Centropomus, Lates e
Psammoperca (LI et al., 2011). O gênero Centropomus é formado por doze espécies,
sendo elas C. undecimalis (BLOCH, 1792); C. poeyi Chávez, 1961; C. parallelus Poey,
1860; C. mexicanus Bocourt, 1868; C. pectinatus Poey, 1860; C. ensiferus Poey, 1860; C.
viridis Lockington, 1877; C. nigrescens Günther, 1864; C. medius Günther, 1864; C.
unionensis Bocourt, 1868; C. armatus Gill, 1863 e C. robalito Jordan & Gilbert, 1882.
Destas, as seis primeiras ocorrem exclusivamente no Oceano Atlântico Ocidental.
No litoral do Brasil tem sido registrada a ocorrência de cinco espécies, com
destacada abundância de C. undecimalis e C. parallelus, especialmente no litoral do
sul/sudeste. A espécie C. poeyi é a única a habitar o Atlântico Ocidental sem registro
de incidência na costa brasileira (VOLKER & ANDREATA, 1982; RODRIGUES, 2005;
MORO, 2008; ANDREATA et al., 2012; MENEZES et al., 2012; SOUSA, 2013). Mais
recentemente uma espécie não descrita foi identificada em um pequeno enclave, na
região norte do Brasil (OLIVEIRA et al., 2014), demonstrando que a família apesar de
apresentar espécies bem definidas ainda não apresenta toda a sua diversidade
estimada.
A composição e monofilia de Centropomidae têm sido debatidas. Apesar da
definição deste grupo ser explicitada pela homogeneidade de seus representantes,
eventualmente tem sido considerada entre os grupos com relações não resolvidas
dentro da Ordem Perciformes (GREENWOOD, 1976). Contudo, análises filogenéticas
recentes, utilizando 13 marcadores moleculares, reforçam a congruência na
delimitação de Centropomidae, apesar de indicações de que Ambassidis, Glaucosoma,
Niphon e Siniperca poderiam fazer parte desta família (LI et al., 2011).
Os representantes dessa família estão dispersos em ambientes marinhos,
estuarinos e de água doce, habitando águas tropicais e subtropicais do Pacífico
Oriental e do Atlântico Ocidental (GREENWOOD, 1976). São vulgarmente conhecidos
como camurins, robalos ou snooks, sendo um grupo bastante homogêneo e compacto
(NELSON, 2006; RIVAS, 1986). Muitas dessas espécies, destacadamente Centropomus
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undecimalis, são importantes na pesca artesanal e desportiva em toda sua área de
distribuição, sobretudo no México e no Brasil (LI et al., 2011; ORRELL, 2002; XIMENES-
CARVALHO, 2006). No litoral sul dos Estados Unidos, o comércio de representantes
dessa família é proibido, sendo toda exploração voltada à pesca esportiva (MULLER,
2000; TAYLOR et al., 2000).
Apesar de suas espécies estarem associadas a diferentes tipos de ambiente,
nenhuma espécie habita ambos os oceanos (TRINGALI et al., 1999). Enquanto algumas
espécies revelam uma ampla distribuição no Atlântico, como C. undecimalis, outras
apresentam distribuição restrita, como C. poeyi que ocorre somente na região do golfo
do México (CHÁVEZ, 1961), e espécie recém identificada e ainda não descrita
(OLIVEIRA et al., 2014) encontrada exclusivamente, no Estado do Amapá, região Norte
do Brasil.
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Figura 1. Relações filogenéticas das espécies de Centropomus baseada no gene
mitocondrial 16S. Em destaque as espécies de ocorrência no litoral brasileiro.
(modificada de Tringali et al., 1999)
Agrupamentos filogenéticos das 12 espécies do gênero Centropomus, baseados
em dados moleculares, as têm agrupado em quatro clados distintos (TRINGALI et al.,
1999). O primeiro é constituído por C. undecimalis, C. viridis, C. poeyi e C. nigrescens; o
segundo por C. mexicanus e C. parallelus; o terceiro por C. pectinatus e C. medius; e o
último por C. ensiferus, C. robalito, C. armatus e C. unionensis (Figura 1). Os clados
obtidos dos dados moleculares se mostram congruentes com agrupamentos baseados
em dados morfológicos, com algumas pontuadas diferenças (FRASER, 1968; RIVAS,
1986).
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Análises filogeográficas são importantes na identificação de estruturação
genética das espécies. No litoral brasileiro, análises populacionais em C. parallelus,
baseadas em sequências mitocondriais, indicaram homogeneidade genética entre
diferentes regiões (PRODOCIMO et al., 2008). O alto fluxo gênico pode estar associado
à ausência de barreiras geográficas físicas, ao período pelágico larval, ovos pelágicos
ou ao próprio desenvolvimento ontogenético. Por outro lado, análises de estruturação
genética em C. undecimalis ao longo do Golfo do México e Mar do Caribe, através de
aloenzimas e RFLP (Restriction fragment length polymorphisms), identificaram pelo
menos duas subpopulações, possivelmente estabelecidas pela presença de gradientes
ambientais diferenciados entre estas regiões (TRINGALI & BERT, 1996).
Entre as causas para a diversificação no gênero Centropomus, a mais
significativa foi o fechamento do istmo do Panamá (RIVAS, 1986), isolando as águas do
Atlântico e do Pacífico, a cerca de 1,6 a 3 milhões de anos (m.a.) (ROCHA, 2003).
Contudo, as datações das divisões filogenéticas disponíveis, apontam uma
diversificação em momentos diferentes, dependendo do ambiente. Para os pares de
espécies cujas histórias de vida estão ligadas ao habitat dulcícola, a diversificação teria
ocorrido por volta do Plioceno (2,5 – 5,3 m.a.), já para os pares de hábito marinho, a
divergência teria ocorrido antes, por volta do fim do Mioceno (10 m.a.) (TRINGALI et
al., 1999).
Entre as principais divergências evolutivas no gênero Centropomus se destaca a
extensa variação no tamanho corporal entre as espécies e clados, e a diversificação
ecológica, referente à variação na preferência por ambientes com alta salinidade dos
indivíduos adultos. De fato, seus membros são descritos como eurialinos, semi-
catádromos e/ou dependente de estuários. Nestes ambientes, quanto maior a ligação
à salinidade, maior o tamanho corporal observado. Assim sendo, C. undecimalis e C.
viridis, por exemplo, que alcançam o maior tamanho corporal, estão associados
principalmente a água salgada. Por outro lado, C. ensiferus e C. robalito com menor
tamanho médio corporal estão associados a ambientes com baixa salinidade (Rivas,
1986). Entretanto, ambientes de água doce ou de baixa salinidade em geral
representam áreas propícias à ocorrência de estágios juvenis de variados
representantes de Centropomus (TRINGALI et al., 1999).
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As espécies de Centropomus são predadores de topo de cadeia (TAYLOR et al.,
2000), alimentando-se principalmente de outros peixes e crustáceos, podendo alterar
sua dieta dependendo do tamanho corporal, da área que estejam habitando e
disponibilidade de alimento (MCMICHAEL et al., 1989; TONINI et al., 2007;
NASCIMENTO et al., 2010).
Segundo Taylor et al. (2000) robalos são peixes hermafroditas protândricos,
que iniciam a vida como machos podendo se tornar fêmeas posteriormente. Os
machos em geral são encontrados em maior proporção, em tamanhos menores que as
fêmeas e alcançam a maturidade sexual mais cedo. Seu ciclo reprodutivo é anual,
podendo ocorrer múltiplas desovas, em ambientes de alta salinidade, sendo as águas
estuarinas seus criadouros naturais (GRIER & TAYLOR, 2001; XIMENES-CARVALHO,
2006). Análises do ictioplâncton na costa da Flórida (sul dos EUA) demonstraram que
larvas de robalos são raramente encontradas em alto mar, indicando que os ovos ou
larvas são transportadas ou mantidas próximos a costa (PETERS et al., 1998).
O cultivo de peixes marinhos encontra-se em ascensão em todo o mundo e tem
revelado grande interesse comercial nos robalos, que por sua adaptação a diferentes
condições ambientais e consumo irrestrito de ração, apresenta-se como um grupo
muito propício ao cultivo. Sua produção em estágio experimental crescente se deve a
alta qualidade de sua carne e valor comercial. No entanto estudos em diversas áreas,
como reprodução, nutrição e melhoramento genético são importantes, sanando
alguns gargalos tecnológicos na produção das principais espécies, como C. parallelus e
C. undecimalis (COSTA-FILHO et al., 2013). Popularmente conhecido como Robalo-
peva, C. parallelus é a espécie cujos aspectos do cultivo estão mais avançados no
Brasil, devido em parte a um maior conhecimento sobre condições ambientais e
nutrição necessária ao desenvolvimento da espécie (ALVES JR. et al., 2006; TSUZUKI et
al., 2007; BORGES et al., 2010; BARROSO et al., 2013, COSTA-FILHO et al., 2013).
Entre as espécies ocorrentes no litoral brasileiro, C. mexicanus é por vezes
confundida com C. parallelus (ORRELL, 2002). Sua distribuição é bastante ampla se
estendendo da Costa do Golfo do México e Grandes Antilhas sul até a cidade de Porto
Alegre (RS) no Brasil. A espécie apresenta porte médio, alcançando no máximo cerca
de 40 cm de comprimento total e média de 18 cm, cujos caracteres taxonômicos são
definidos pela presença de 10 raios moles na nadadeira dorsal, seis raios na nadadeira
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anal e 14 a 16 raios na nadadeira peitoral, 15 escamas a partir da origem da segunda
nadadeira dorsal até a linha média, e de 68 a 78 escamas na linha lateral (ORRELL,
2002). Ocorre geralmente em ambientes de água salgada, mas pouco se conhece
sobre sua migração ou locais de desova.
Centropomus undecimalis está entre as espécies que dispõem de maior
conhecimento biológico. O robalo-flecha, como é conhecido popularmente, é o maior
dos robalos podendo alcançar os 130 cm de comprimento total e 23 Kg. Sua cabeça é
ligeiramente côncava e sua mandíbula inferior se projeta além da superior, em geral
possuem 10 raios moles na nadadeira dorsal, nadadeira anal com 3 raios duros e de 5 a
7 raios moles e 14 a 16 raios na nadadeira peitoral. A linha lateral formada por 67 a 72
escamas, se estende até a margem posterior da nadadeira caudal, apresenta ainda 67
a 77 escamas na linha acima da linha lateral e de 22 a 28 escamas em torno da
nadadeira caudal. Apesar do tamanho máximo de alguns exemplares, seu tamanho
médio é de 50 cm e 2,2 Kg (ORRELL, 2002). Habitam águas costeiras, estuários e lagoas
onde se alimentam de peixes e crustáceos. Sua desova ocorre durante os meses de
maio a setembro, e sua distribuição se dá desde o sul da Flórida (EUA), até o sul do Rio
de Janeiro no Brasil (OLIVEIRA et al., 2014).
Espécimes de C. undecimalis rotineiramente atravessam e habitam o mar
aberto. Apresentam tamanho corporal maior e alta capacidade e velocidade de
natação. Estas características permitem a expansão do leque alimentar, uma vez que
possibilita a apreensão de presas maiores e mais diversas (RIVAS, 1986; ORRELL, 2002;
MENDONÇA, 2004).
Características citogenéticas vem sendo crescentemente utilizadas como
subsídios a hipóteses filogenéticas vigentes e na detecção de aspectos evolutivos de
peixes (MOLINA, 2007). Dados cromossômicos têm possibilitado entre outros
aspectos, observar alterações cromossômicas exclusivas de espécies, bem como
indicativas da presença de barreiras pós-zigóticas efetivas entre algumas espécies. A
possibilidade de comparações intra e interespecíficas, eleva a compreensão dos
padrões evolutivos, com reflexos na taxonomia e sistemática de grupos, bem como na
identificação de arranjos cromossômicos responsáveis pela especiação (KASAHARA,
2009).
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Apesar da alta diversidade que caracteriza a ordem Perciformes, os aspectos
citogenéticos de muitos dos seus grupos, em geral revelam grande homogeneidade
cariotípica. De fato, cerca de 60% das espécies compartilham um cariótipo com
número diploide (2n) com 48 cromossomos acrocêntricos, o que se acredita ser uma
condição plesiomórfica para o grupo. Da mesma forma, seus cromossomos em geral
compartilham um baixo conteúdo heterocromático e regiões organizadoras de
nucléolo localizadas sobre um único par cromossômico, características consideradas
basais nos Perciformes (GALETTI et al., 2000).
Os ambientes continentais, ao contrário dos ambientes marinhos, apresentam
um número maior e mais efetivo de barreiras geográficas, ocasionando em muitos
casos, pronunciado ou completo bloqueio ao fluxo gênico. Esta condição resulta em
uma maior diversificação cariotípica em espécies dulcícolas do que a normalmente
encontrada em peixes marinhos (GALETTI et al., 2000; MOLINA, 2007).
A falta de conhecimento citogenético em diversos grupos ainda é um obstáculo
para o seu pleno conhecimento biológico (ARAI, 2011). Esta é uma condição
encontrada em Centropomidae, onde as informações citogenéticas na família são
taxonomicamente restritas e limitadas ao conhecimento do número diploide e fórmula
cariotípica (ARIAS-RODRIGUEZ, 2011; ARAI, 2011).
Levantamentos da ictiofauna do litoral do Rio Grande do Norte têm reportado a
ocorrência de cinco espécies de Centropomus, com marcada frequência das espécies C.
undecimalis e C. parallelus (MENDONÇA, 2004; GARCIA, 2006; NASCIMENTO et al.,
2010; MORAIS et al., 2012). Contudo, diante da existência de características
morfológicas crípticas entre algumas espécies, uma certa imprecisão pode ocorrer na
identificação das espécies, influenciando na correta determinação da diversidade de
espécies. Tendo em vista que as espécies apresentam considerável variação quanto ao
período de primeira maturação sexual (RODRIGUES, 2005; PEREIRA-GARCIA et al.,
2011), a correta identificação adquire importância adicional em medidas de exploração
e conservação das espécies.
No presente estudo, espécimes do gênero Centropomus foram coletados em
diferentes ambientes e regiões do litoral do Rio Grande do Norte e analisados quanto
aos padrões morfológicos, padrões das sequências mitocondriais do gene 16S e
aspectos citogenéticos. Os resultados apresentam o quadro da diversidade de espécies
19
em um importante trecho do litoral nordeste do Brasil e analisa a evolução cariotípica
no gênero Centropomus.
2. OBJETIVO GERAL
Diante de incertezas sobre a ocorrência de espécies de Centropomus no litoral
do Rio Grande do Norte objetivou-se determinar por meio de aspectos morfológicos,
padrões genéticos e citogenéticos, a diversidade de espécies na região e aspectos da
evolução cariotípica neste gênero.
3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificação taxonômica comparativas utilizando dados morfológicos e perfis
das sequências mitocondriais 16S de espécies de Centropomus ocorrentes no
litoral do Rio Grande do Norte;
Determinação dos aspectos da evolução cariotípica e caracteres
citomarcadores em espécies do gêneo Centropomus, por meio de técnicas
clássicas (coloração convencional com Giemsa, bandamento-C e técnica de
Ag-RONs), coloração com fluorocromos base-específicos (MM/DAPI), bandas
de replicação pela incorporação do análogo de base 5´BrdU e mapeamento de
sequências (TTAGGG)n e dos genes ribossomais 5S e 18S por meio da técnica
de hibridização fluorescente in situ (FISH).
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. MATERIAL
As coletas de indivíduos do gênero Centropomus foram realizadas em três
localidades do estado do Rio Grade do Norte. O primeiro ponto de captura foi a Lagoa
do Jiqui (5°55'07,5"S 35°11'17,1"O), que é um alargamento do rio Pitimbu, localizada
no município de Parnamirim, pertencente à bacia hidrográfica do rio Pitimbu, sendo
utilizada para o abastecimento de água de grande parte da cidade de Natal. Outros
exemplares foram coletados próximos a Lagoa de Guaraíra, na Bacia do Rio Jacu,
20
município de Arês (6°12'00,0"S 35°09'14,4”O). O terceiro ponto de coleta foi no rio
Ceará-Mirim, que compõe a bacia de mesmo nome, no município de Extremoz
(5°41'05,9"S 35°14'26,5"O) (Figura 2). Os exemplares vivos foram capturados por meio
de redes (tarrafa e rede de arrasto) e linha e anzol, fazendo uso em alguns casos do
auxílio de pescadores artesanais nas áreas de estudo. As espécies foram identificadas
segundo Orrell (2002).
21
Figura 2. Áreas de distribuição das espécies Centropomus undecimalis e C. mexicanus
no Atlântico. Locais de coleta dos espécimes no litoral do Estado do Rio Grande do
Norte. (a) Extremoz (5°41'05,9"S 35°14'26,5"O); (b) Lagoa do Jiqui – Parnamirim
(5°55'07,5"S 35°11'17,1"O); e (c) município de Arês (6°12'00,0"S 35°09'14,4"O).
4.2. OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS MITÓTICOS E ANÁLISES CITOGENÉTICAS
Os espécimes foram submetidos à estimulação mitótica in vivo por 24 a 48
horas com complexos de antígenos inoculados em região intramuscular, na proporção
de 1ml/50g de peso corporal (MOLINA, 2001; MOLINA et al., 2010). Após a
estimulação mitótica os exemplares foram sacrificados com superdosagem do
anestésico Eugenol (óleo de cravo). Fragmentos do rim anterior foram removidos e
dissociados em meio de cultura RPMI 1640, com o auxílio de seringas de vidro, de
acordo com a metodologia preconizada por Gold et al. (1990). Nesta suspensão de
a
b
c
Atlântico
Brasil
22
células foram adicionadas cinco gotas de solução de colchicina a 0,025% por 30
minutos, em temperatura ambiente. O material foi centrifugado por 10 minutos à 900
rpm. O sobrenadante foi removido e acrescentou-se 9ml de solução hipotônica de KCl
(0,075M), à temperatura ambiente, por 30 minutos. Decorrido este tempo, foi
adicionado 0,5ml de solução de Carnoy (metanol e ácido acético – 3:1) e o material foi
centrifugado por 10 minutos a 900 rpm. Após centrifugação, remoção do
sobrenadante e ressuspensão em solução de Carnoy recém-preparada, o material foi
centrifugado e o sobrenadante descartado por mais dois ciclos (10 minutos à 900 rpm).
A suspensão celular foi conservada à -20°C em tubos tipo Eppendorf de 1,5ml, para
análises posteriores.
Um total de 150μl (3 gotas) de suspensão celular foi gotejado sobre lâminas
recobertas por um filme de água destilada aquecida à 60°C, as quais foram secas e
posteriormente coradas com Giemsa à 5%, diluído em tampão fosfato pH 6,8. As
análises citogenéticas foram realizadas em aumento de 1.000X em microscópio ótico.
Cerca de trinta metáfases foram analisadas para cada espécime. As melhores
metáfases foram fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência Olympus™
BX51 acoplado a um sistema digital de captura de imagens Olympus DP73® utilizando
o software CellSens© (Olympus Optical Co. Ltd.). Para a montagem do cariótipo, os
cromossomos foram classificados quanto à posição dos centrômeros, em
metacêntricos (m), com a razão entre o braço maior e menor (RB) variando de 1,00 a
1,70; submetacêntricos (sm), RB=1,71–3,00; subtelocêntricos (st), RB=3,01–7,00; e
acrocêntricos (a), RB>7,01 (Levan et al., 1964).
4.2.1. Detecção de regiões organizadoras de nucléolos
Para análise das regiões organizadoras de nucléolos foi utilizada a técnica
preconizada por Howell & Black (1980), que consiste em cobrir uma lâmina, preparada
com suspensão celular, com cerca de 450 μl (9 gotas) de uma solução de gelatina (1g
de gelatina, dissolvida em 50 ml água e 0,5 ml ácido fórmico) e 300 μl (6 gotas) de
nitrato de prata (AgNO3) à 50%. Ambas as soluções foram homogeneizadas sobre a
lâmina, recoberta por uma lamínula e incubada em estufa a 60°C até que se obtivesse
23
uma cor amarelo âmbar. Logo após a lamínula foi retirada com jatos de água, secas ao
ar.
4.2.2. Detecção da heterocromatina constitutiva
Os blocos heterocromáticos foram detectados através do bandamento C,
segundo a metodologia descrita por Summer (1972). Resumidamente, lâminas com o
material celular foram mantidas em estufa a 37°C por três dias. Decorrido este
período, foram imersas em HCL 0,2N à temperatura ambiente, por 15 minutos, sendo
posteriormente lavadas com água destilada e secas. Em seguida, foram mergulhadas
por 1 minuto e 30 segundos em uma solução saturada de hidróxido de bário
(Ba(OH)28H2O) à 5%, previamente aquecida a 42°C. Foram rapidamente lavadas em
HCl 0,1N e em seguida em água destilada. Após secagem foram imersas em solução
salina 2xSSC à 60°C por 40 minutos, lavadas em água destilada e novamente secas.
Para visualização das regiões heterocromáticas, o material foi corado com Giemsa 5%
por 5 minutos.
4.2.3. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos
O fluorocromo Mitramicina (MM) foi empregado para a detecção de regiões
ricas em bases G-C e o fluorocromo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) para identificar
regiões ricas em bases A-T, de acordo com Schweizer (1980). As lâminas com
suspensão celular foram coradas com 30µl de Mitramicina 0,5 mg/ml recobertas com
lamínulas e colocadas em câmara úmida, no escuro, sendo lavadas com água destilada
após um período de 60 minutos. Após secas as lâminas foram coradas com 30 µl de
DAPI (2µl/ml), cobertas novamente por lamínulas e mantidas em câmara úmida, no
escuro, por 30 minutos. Posteriormente as lâminas foram lavadas com água destilada
e montadas com tampão glicerol-Mcllvaine pH 7,0 (1:1) cobertas com lamínulas e
seladas com esmalte incolor. As lâminas foram então mantidas em câmara escura à
4oC e analisadas após um prazo mínimo de três dias com fotomicroscópio de
epifluorescência sob filtros apropriados.
24
4.2.4. Incorporação do análogo de base 5’BrdU
A incorporação do análogo de base 5’BrdU (5-bromo-2’-deoxiuridina) seguiu a
metodologia preconizada por Giles et al. (1988). Brevemente, foi inoculada
intraperitonealmente in vivo, o análogo de base 5’BrdU (5-bromo-2’-deoxiuridina)
(5mg/ml em solução 0,9% NaCl), na proporção de 1ml/100g de peso corporal do
indivíduo, deixando agir entre 7 a 8 horas. Posteriormente, os indivíduos foram
sacrificados e submetidos à técnica de obtenção cromossômica previamente descrita.
Lâminas preparadas com as suspensões celulares dos exemplares foram mantidas por
dois dias em estufa à 37oC e após esse período, lavadas em solução de 2xSSC, sendo
coradas no escuro, com 40 µl de Hoescht 6024 (Sigma) (1mg de Hoescht/1 ml de
metanol e 100ml de 0,5xSSC). Em seguida foram recobertas por uma lamínula e
incubadas por 60 minutos em câmara escura umedecida. As lâminas foram lavadas
com jatos de água destilada para a retirada das lamínulas e do corante e
posteriormente secas ao ar. Em seguida as lâminas foram recobertas com um filme de
2xSSC, sendo expostas à luz de uma lâmpada ultravioleta 15 watts (254nm) a uma
distância de 10 cm em uma câmara escura por um período de 60 minutos. Por último,
as lâminas foram incubadas em 2xSSC à 60oC, por 20 minutos, lavadas com água
destilada e secas ao ar. As lâminas foram coradas com solução de Giemsa a 5%, diluído
em tampão fosfato pH 6,8, durante 10 minutos, lavadas com água destilada, secas ao
ar e analisadas sob microscopia ótica.
4.3. MAPEAMENTO IN SITU DE REGIÕES (TTAGGG)N
Para as marcações teloméricas foi utilizado o kit Telomere PNA FISH/FITC,
seguindo as recomendações do fabricante (DakoCytomation, Dinamarca).
25
4.4. HIBRIDAÇÃO FLUORESCENTE IN SITU (FISH)
4.4.1. Obtenção de sondas
As sondas para emprego em dual-color FISH foram obtidas por amplificação do
DNA da espécie Ocyurus chrysurus, utilizando primers para DNAr 18S (HATANAKA &
GALETTI, 2004) e DNAr 5S (MARTINS & GALETTI, 1999). As sondas DNAr 18S foram
marcadas por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Roche) e a sonda DNAr 5S
com biotina-14-dATP (Roche), de acordo com as especificações do fabricante.
4.4.2. Hibridização
A técnica de FISH (Fluorescence in situ hybridization) foi realizada em
cromossomos mitóticos, de acordo com o protocolo desenvolvido por Pinkel et al.
(1986). Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de DNAse (20mg/mL em
2×SSC) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005 % em HCl 10mM) à 37°C, por 10
minutos, e fixados com formaldeído a 1%, por 10 minutos. Em seguida desidratados
em série alcoólica (70%, 85% e 100%). Os cromossomos foram desnaturados em
solução de 70% formamida/2×SSC à 72°C, por 5 minutos. Uma solução de hibridização
consistindo de 50% de formamida, 2×SSC, 10% de sulfato dextrano e a sonda
desnaturada (5 ng/µl) foi depositada sobre as lâminas, que foram recobertas com
lamínula. Após a hibridização em câmara úmida, overnight à 37°C, as lâminas foram
lavadas em 15% formamida/0,2×SSC à 42°C, por 20 minutos, 0,1×SSC à 60°C, por 15
minutos e Tween 20 0,5%/4×SSC, à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da
sonda foi detectado usando avidina-FITC (Sigma) para a sonda DNAr 5S e anti-
digoxigenina rodamina (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram
contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml).
As preparações com FISH e fluorocromos base específicos foram analisadas em
fotomicroscópio de epifluorescência Olympus BX51, equipado com sistema digital de
captura de imagens Olympus DP73, utilizando o software CellSens (Olympus Optical
Co. Ltda.)
26
4.5. OBTENÇÃO DE SEQUÊNCIAS MITOCONDRIAIS 16S
Fragmentos de tecido muscular e/ou hepático foram obtidos de amostras de
exemplares das três localidades analisadas, acondicionados em microtubos (1,5 ml)
contendo álcool etílico 100% e armazenados à temperatura de -20°C. O DNA total foi
extraído de acordo com o protocolo de Sambrook et al. (1989).
As reações de PCR foram preparadas com volume final de 25 μL, consistiam em
1 μL de DNA total, 0,5U Taq polimerase (Bio-Line USA, Boston, Massachusetts), 0,4 μL
de 50 mM MgCl2, 1 μL de 10×buffer, 0,5 μL 10 mM dNTP (desoxiribonucleotídeo
trifosfato), 0,3 μL de 10 μM de cada primer (L1987: 5′-GCCTCGCCTGTTTACCAAAAAC-3′;
H2609: 5′-CGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′) (PALUMBI et al., 1991) e água ultrapura
para completar o volume final da reação. Os ciclos de temperatura utilizados
empregaram uma desnaturação inicial à 95°C (5 minutos); seguido por 30 ciclos de
94°C (30 segundos), 49°C (30 segundos), 72°C (55 s segundos). Foi realizada uma
extensão final de 72°C por 5 minutos. Os produtos da PCR foram purificados com a
enzima ExoSAP-IT (USB, Cleveland, Ohio) seguindo o protocolo do fabricante.
Posteriormente, as amostras de DNA foram sequenciadas, pela empresa ACTGene,
utilizando o equipamento ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
As sequências obtidas foram visualizadas e editadas com o auxílio do programa
BioEdit v. 5.0.6 (HALL, 1999). Ao todo foram obtidos 584 pb do gene mitocondrial 16S,
as quais foram alinhadas de forma múltipla através do software ClustalW (THOMPSON
et al., 1994). O programa jModelTest2© (DARRIBA et al., 2012) foi utilizado na escolha
do modelo evolutivo HKY+I para as sequências.
27
5. CAPÍTULO 1
Incongruências entre caracteres morfológicos e moleculares (DNAmt
16S) na identificação taxonômica de espécies do gênero Centropomus
(Perciformes)
RESUMO
Um total de seis espécies do gênero Centropomus (Centropomidae), conhecidos
popularmente como robalos, habitam o litoral brasileiro. A identificação taxonômica
entre estas espécies pode ser difícil, já que algumas apresentam simpatria,
características ecológicas semelhantes e possuem características morfológicas
crípticas, o que propicia registros de ocorrência com algum grau de imprecisão. Para o
litoral do Rio Grande do Norte (RN), nordeste do Brasil, tem sido relatada a ocorrência
de cinco espécies, C. undecimais, C. parallelus, C. mexicanus, C. ensiferus e C.
pectinatus. Espécimes de Centropomus provenientes de três pontos de coleta ao longo
do litoral do RN foram identificados por chave de identificação taxonômica e tiveram
suas sequências mitocondriais 16S comparadas com as espécies do gênero. As
identificações taxonômicas dos espécimes indicaram uma significativa incongruência
entre o uso de dados morfológicos e moleculares. Adicionalmente, as análises
comparativas de sequências DNAmt 16S revelaram apenas a presença das espécies C.
undecimalis e C. mexicanus. Os resultados apontam uma menor diversidade do que se
supunha nas regiões amostradas, contribuindo para a reavaliação da ocorrência de
espécies no litoral do Rio Grande do Norte.
Palavras-chaves: Robalo. Morfologia críptica. DNAmt 16S. Validação taxonômica.
28
INTRODUÇÃO
A família Centropomidae, posicionada entre os Percoidei basais (LI et al., 2011),
é composta por espécies com morfologia conservada, sobretudo no gênero
Centropomus (TRINGALI et al., 1999; ORRELL, 2002). Preliminarmente foram descritas
cerca de 30 espécies para o gênero Centropomus, exclusivo das Américas, contudo
atualmente somente 12 espécies são consideradas válidas, com metade habitando o
oceano Pacífico e metade o Atlântico (RIVAS, 1986; ORRELL, 2002). Em geral são
importantes componentes na pesca artesanal e esportiva em suas áreas de
distribuição (ORRELL, 2002; XIMENES-CARVALHO, 2006).
Diferentemente de outros grupos, que apresentam hábitos ecológicos estritos,
as espécies do gênero Centropomus, habitantes de águas tropicais (GREENWOOD,
1976), podem ser eurialinas, semi-catádromas e estuarinas-dependentes, não exibindo
marcada estratificação nos ambientes habitados (RIVAS, 1986). Esta plasticidade
ecológica indica características fisiológicas compartilhadas entre suas espécies (MORO,
2008). Tem sido observada uma relação entre tamanho corporal e salinidade do
ambiente preferencial das espécies. Quanto mais salino o ambiente maior o tamanho
corporal que as espécies apresentam. Essa relação ecológica tem sido apontada como
um dos possíveis fatores de diversificação do gênero (TRINGALI et al., 1999).
Apesar de serem predadores de topo de cadeia (TAYLOR et al., 2000), sua dieta,
em geral, composta por peixes e crustáceos (CHÁVEZ, 1961; MENDONÇA, 2004), pode
se diversificar dependendo do tamanho corporal e disponibilidade do alimento
(MCMICHAEL et al., 1989; TONINI et al., 2007; CERQUEIRA & TSUZUKI, 2009;
NASCIMENTO et al., 2010).
Estuários são conhecidos como seus criadores naturais, sendo seu ciclo
reprodutivo anual em ambientes de alta salinidade. Em seus estágios iniciais os robalos
se desenvolvem em áreas costeiras, possuem alimentação baseada em microalgas e se
mantem em cardumes, modificando essas características ao longo do seu crescimento
(GILMORE et al., 1983; CERQUEIRA, 2005). A baixa representatividade de suas larvas
ligadas ao plâncton pelágico indica que seus ovos e larvas apresentam dispersão
próxima a costa (PETERS et al., 1998; GRIER & TAYLOR, 2001; XIMENES-CARVALHO,
2006).
29
A diversificação evolutiva do gênero parece estar relacionada ao período
posterior ao fechamento do Istmo do Panamá (1,6 a 3 m.a), cujo bloqueio entre os
oceanos Pacífico e Atlântico criou condições propicias à especiação alopátrica
(TRINGALI et al., 1999).
O gênero Centropomus, cujas espécies tiveram diversificação recente e
apresentam características morfológicas crípticas, demandam maior grau de acuidade
quanto à inferências filogenéticas e identificação taxonômica. Neste sentido, sob
condições de homogeneidade morfológica entre espécies, as sequências mitocondriais
vêm sendo utilizadas, tanto na definição de diferenças interpopulacionais, como
interespecíficas, em diversas famílias de Perciformes (RITCHIE et al., 1997; BERNARDI
et al., 2000; FARIAs et al, 2000; SANTOS et al., 2003). Algumas sequências, como as do
gene mitocondrial 16S, têm se mostrado particularmente eficientes na definição da
história evolutiva do gênero Centropomus (TRINGALI et al., 1999).
Para o litoral brasileiro tem sido relatada a presença de cinco espécies do
gênero Centropomus, com marcada predominância de C. undecimalis e C. parallelus,
todas com ocorrência registrada para a costa do Estado do Rio Grande do Norte
(MENDONÇA, 2004; GARCIA, 2006; NASCIMENTO et al., 2010; MORAIS et al., 2012).
Muitas vezes os registros de ocorrência decorrem de extensos levantamentos de
fauna, sem a oportunidade de revalidação detalhada para grupos específicos. Esta
condição é particularmente sensível para as espécies do gênero Centropomus, diante
de suas características morfológicas e merísticas que podem causar dificuldades na
identificação como relatado para C. parallelus e C. mexicanus (TRINGALI et al., 1999;
ORRELL, 2002). Também do ponto de vista genético ambas espécies não podem ser
individualmente diferenciadas utilizando-se apenas dados alozímicos (TRINGALI et al.,
1999).
Levantamentos ictiofaunísticos ao longo do litoral brasileiro demonstram
marcada predominância das espécies C. undecimalis e C. parallelus. No litoral sul do
Brasil a espécie C. parallelus vem sendo frequentemente reportada. No Estado de
Santa Catarina, apesar de registros de ocorrência, tanto de C. undecimalis, como de C.
parallelus, ocorre uma expressiva predominância da última (Beninca, 2001; HOSTIM-
SILVA et al., 2002; MENEZES et al., 2012). Da mesma forma, no litoral dos Estados do
Paraná e Rio Grande do Sul (HALUCH et al., 2004; BECKER et al., 2007). Em regiões
30
próximas, mais ao sul, como no litoral norte do Rio Grande do Sul um levantamento
ictiológico, além da ocorrência de C. parallelus, sugere a presença simpátrica de C.
mexicanus (SOUSA, 2013).
Nas bacias e litoral sudeste do Brasil se repete a predominância de C. parallelus
e a presença de C. undecimalis (VOLKER & ANDREATA, 1982; ANDREATA et al., 2002;
TEIXEIRA et al., 2005; ANDREATA et al., 2012), além de relatos de ocorrência de C.
pectinatus (RODRIGUES, 2005). Na região Nordeste há indicações de uma maior
diversidade, com a ocorrência, além de C. parallelus e C. undecimalis, de C. ensiferus,
C. pectinatus e de C. mexicanus, com o status a confirmar (GARCIA, 2006; Lira &
TEIXEIRA, 2008; NASCIMENTO et al., 2010; SOARES, 2011).
As espécies C. parallelus e C. mexicanus ocorrem em simpatria, desde o golfo
do México até o sul do Brasil, enquanto as espécies C. ensiferus, C. pectinatis e C.
undecimalis se distribuem desde a Flórida, nos Estados Unidos, ou Golfo do México,
até o Estado do Rio de Janeiro (ORRELL, 2002).
A extensa sobreposição das espécies de Centropomus no Atlântico Ocidental,
nem sempre perfeitamente identificadas, sugere a necessidade de uma revisão de suas
distribuições. A revalidação da diversidade de espécies em pontos do litoral brasileiro
proporcionará bases mais sólidas para o manejo, a conservação e usos práticos na
piscicultura. Diante disto, espécimes de Centropomus, provenientes de três regiões
geográficas do litoral do Rio Grande do Norte, tiveram suas identificações taxonômicas
comparadas através de chaves de identificação e comparações com perfis do DNAmt
16S de espécies do gênero.
MATERIAL E MÉTODOS
As coletas foram realizadas em três localidades no litoral do Rio Grande do
Norte: Lagoa do Jiqui pertencente à bacia hidrográfica do Rio Pitimbu no município de
Parnamirim/RN (5°55'07,5"S 35°11'17.1"O) (n=13), no município de Arês/RN, na bacia
hidrográfica do Rio Jacu (6°12'00,0"S 35°09'14,4"O) (n=11) e no município de
Extremoz, no estuário do rio Ceará-Mirim (5°41'05.9"S 35°14'26,5"O) (n=13) (Figura 2).
Todos os espécimes foram identificados morfologicamente através da chave de
identificação proposta por Orrell (2002). Segundo Sousa (2013) ela apresenta uma
31
simplificação da chave proposta por Rivas (1986), e que pela confiabilidade, foi
utilizada para identificação dos espécimes.
Para as análises genéticas foram utilizadas amostras de tecido de no minímo
três espécimes de cada local de coleta, que tiveram seu DNA total extraído de acordo
com Sambrook et al. (1989). Sequências do gene mitocondrial 16S foram amplificadas
pelo método de reação em cadeia da polimerase (PCR). As reações de PCR foram
preparadas para um volume final de 25 μL, consistindo de 1 μL de DNA total, 0.5U Taq
polimerase, 0.4 μL de 50 mM MgCl2, 1 μL de 10 × buffer, 0.5 μL 10 mM dNTP, 0.3 μL de
10 μM de cada primer (L1987 e H2609, PALUMBI et al., 1991) e água ultrapura para
completar o volume final da reação. Para a amplificação das sequências foi utilizado
um ciclo inicial de desnaturação a 95°C (5 min), seguido por 30 ciclos a 94°C (30 s),
49°C (30 s), 72°C (55 s) e uma extensão final a 72°C, por 5 minutos. Os produtos da PCR
foram purificados com a enzima ExoSAP-IT e sequenciados pela ACTGene Análises
Moleculares. As sequências obtidas foram editadas com o BioEdit (Hall, 1999) e
alinhadas com sequências previamente depositadas no GenBank (Centropomus
undecimalis, KC146856; Centropomus undecimalis, CUU85012; Centropomus
undecimalis, AF247436; Centropomus pectinatus, CPU85018; Centropomus parallelus,
CPU85016; e Centropomus mexicanus, CMU85017) através do programa MUSCLE©
(Edgar, 2004), implementado no MEGA6© (TAMURA et al., 2013). O MEGA6©
também foi utilizado para as análises de Agrupamento de Vizinhos (NJ) e na estimativa
da distância genética entre os táxons.
32
Figura 3. Áreas de coleta dos exemplares de Centropomus ao longo do litoral do Rio
Grande do Norte (RN). (a) Estuário do Rio Ceará-Mirim, Extremoz-RN, (b) Lagoa do
Jiqui, Parnamirim-RN (Bacia do Rio Pitimbu), (c) Estuário do Rio Jacu, Município de
Arês.
RESULTADOS
Com base em chave de identificação taxonômica (ORRELL, 2002), os espécimes
coletados na Lagoa do Jiqui foram identificados como C. undecimalis e C. pectinatus
(em maior frequência) (Tabela 1), enquanto que os espécimes coletados no estuário
do Rio Ceará-mirim foram identificados exclusivamente como C. pectinatus. Entre os
indivíduos coletados no estuário do Rio Jacu foi identificado um espécime como C.
parallelus, e os demais identificados como C. pectinatus. Entretanto, ao se comparar as
sequências 16S (584 pares de bases) destes mesmos espécimes com as sequências de
Centropomus previamente depositadas no GenBank, percebe-se que há, entre os
métodos morfológico e molecular, resultados quase inteiramente divergentes em
relação a identificação dos táxons amostrados (Quadro 1).
a
b
c
33
Um espécime coletado na Lagoa do Jiqui foi identificado como C. undecimalis
pelos parâmetros morfológicos, revelando também uma alta similaridade genética
(Tabela 2) com sequências 16S de C. undecimalis (99,0 e 99,5%) (KC146856,
CUU85012, AF247436). Ao contrário disto, os espécimes identificados
morfologicamente como pertencentes a espécie C. pectinatus apresentaram perfis
genéticos idênticos a C. mexicanus (CMU85017).
Os espécimes coletados no Rio Ceará-mirim e Rio Jacu foram, em sua maioria,
identificados morfologicamente como C. pectinatus, porém possuíam alta similaridade
genética com C. undecimalis (99,3%) (KC146856, CUU85012, AF247436) e
significativamente mais baixa homologia com as sequências de C. pectinatus (88,6%)
(CPU85018). Da mesma forma, um espécime coletado no município Arês/RN
morfologicamente identificado como C. parallelus apresentou completa similaridade
genética com a espécie C. undecimalis (KC146856, CUU85012, AF247436).
34
Figura 4. Exemplares das espécies Centropomus undecimalis (acima) e C. mexicanus
(abaixo), identificados por perfis genéticos do DNAmt 16S em diferentes pontos do
litoral do Rio Grande do Norte. Barra: 5 cm.
35
Figura 5. Árvore gerada pelo método de Neighbor-Joining baseada em sequências parciais do gene mitocondrial 16S de indivíduos de Centropomus. Em destaque o agrupamento contendo exemplares de C. undecimalis (destaque em laranja) das três localidades amostradas. Clado composto por espécimes com identidade com a espécie C. mexicanus (caixa em azul). Valores de bootstrap (10.000 replicações) são mostrados nos ramos. Em parênteses estão os números de acesso no GenBank de sequências para diferentes espécies de Centropomus.
36
Tabela 1. Dados merísticos dos espécimes de Centropomus coletados em diferentes pontos do litoral do Rio Grande do Norte e identificação taxonômica a partir de dados morfométricos.
Raios moles nadadeira anal Escamas da linha lateral Raios moles nadadeira dorsal
Espécies/ Espécimes
CUN CP CPA CM CUN CP CPA CM CUN CP CPA CM
5-7 7-8 5-7 5-7 67-78 61-72 79-82 68-79 8 10 9-11 9
C2 Jiqui 7 7 7 7 77 - - 77 - 10 10 -
C3 Jiqui 7 7 7 7 - - 79 79 - 10 10 -
C5 Arês 7 7 7 7 74 - - 74 - 10 10 -
C6 Arês 7 7 7 7 70 70 - 70 - - 11 -
C7 Arês 7 7 7 7 73 - - 73 - 10 10 -
C8 Arês 7 7 7 7 70 70 - 70 - 10 10 -
C9 Ext 7 7 7 7 70 70 - 70 - 10 10 -
C10 Ext 7 7 7 7 73 - - 73 - - 11 -
C11 Ext 7 7 7 7 72 72 - 72 - 10 10 -
Raios moles nadadeira peitoral Rastros branquiais Identificação Taxonômica
Espécies/ Espécimes
CUN CP CPA CM CUN CP CPA CM
14-17 13-15 14-17 14-17 08-10 14-17 08-10 14-17
C2 Jiqui 15 15 15 15 - 14 - 14 C. pectinatus
C3 Jiqui 15 15 15 15 - 14 - 14 C. pectinatus
C5 Arês 15 15 15 15 12 12 12 12 C. parallelus
C6 Arês - 13 - - 13 13 13 13 C. pectinatus
C7 Arês 14 14 14 14 12 12 12 12 C. pectinatus
C8 Arês 14 14 14 14 12 12 12 12 C. pectinatus
C9 Ext 15 15 15 15 11 - - - C. pectinatus
C10 Ext 15 15 15 15 12 12 12 12 C. pectinatus
C11 Ext 15 15 15 15 12 12 12 12 C. pectinatus
CUN – C. undecimalis; CP – C. pectinatus; CPA – C. parallelus; e CM – C. mexicanus; Jiqui – Lagoa do Jiqui; Arês – estuário do Rio
Jacu; Ext – Extremoz, estuário do Rio Ceará-Mirim.
37
Tabela 2. Estimativa da divergência genética entre sequências do gene mitocondrial 16S (584 pares de bases) de Centropomus. Acima diagonal: Desvio padrão. Abaixo diagonal: divergência genética entre as sequências. As análises foram conduzidas utilizando distância p e os gaps considerados como deleção par-a-par. Em parênteses encontram-se os números de acesso do GenBank. CUN – C. undecimalis; CP – C. pectinatus; CPA – C. parallelus; e CM – C. mexicanus; Jiqui – Lagoa do Jiqui; Arês – estuário do Rio Jacu; Extremoz – Estuário do Rio Ceará-Mirim.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1. CM(CMU85017) 0,000 0,000 0,000 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,005
2. C2 Jiqui 0,000 0,000 0,000 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,005
3. C3 Jiqui 0,000 0,000 0,000 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,005
4. C4 Jiqui 0,000 0,000 0,000 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,012 0,005
5. C6 Arês 0,089 0,088 0,088 0,088 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,003 0,004 0,012
6. C7 Arês 0,090 0,090 0,090 0,090 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,004 0,004 0,012
7. C8 Arês 0,089 0,088 0,088 0,088 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,003 0,004 0,012
8. C9 Extremoz 0,089 0,088 0,088 0,088 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,003 0,004 0,012
9. C10 Extremoz 0,089 0,088 0,088 0,088 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,003 0,004 0,012
10. C11 Extremoz 0,089 0,088 0,088 0,088 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,003 0,004 0,012
11. C5 Arês 0,089 0,088 0,088 0,088 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,003 0,004 0,012
12. C1 Jiqui 0,089 0,088 0,088 0,088 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,003 0,004 0,012
13. CUN (AF247436) 0,097 0,097 0,097 0,097 0,005 0,007 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,003 0,013
14. CUN (CUU85012) 0,097 0,099 0,099 0,099 0,010 0,012 0,010 0,010 0,010 0,010 0,010 0,010 0,005 0,012
15. CPA(CPU85016) 0,012 0,012 0,012 0,012 0,091 0,092 0,091 0,091 0,091 0,091 0,091 0,091 0,099 0,099
16. CP (CPU85018) 0,082 0,082 0,082 0,082 0,114 0,114 0,114 0,114 0,114 0,114 0,114 0,114 0,123 0,123 0,083
38
Quadro 1. Identificação taxonômica comparativa dos espécimes de Centropomus, através de dados morfológicos e moleculares (sequências DNAmt 16S).
Espécimes Padrões morfológicos DNAmt 16S
C1 Jiqui C. undecimalis = C. undecimalis
C2 Jiqui C. pectinatus ≠ C. mexicanus
C3 Jiqui C. pectinatus ≠ C. mexicanus
C4 Jiqui C. pectinatus ≠ C. mexicanus
C5 Arês C. parallelus ≠ C. undecimalis
C6 Arês C. pectinatus ≠ C. undecimalis
C7 Arês C. pectinatus ≠ C. undecimalis
C8 Arês C. pectinatus ≠ C. undecimalis
C9 Ext C. pectinatus ≠ C. undecimalis
C10 Ext C. pectinatus ≠ C. undecimalis
C11 Ext C. pectinatus ≠ C. undecimalis
Discussão
Diante das incongruências entre a identificação taxonômica por caracteres
morfológicos e o sequenciamento dos espécimes, nota-se alguma fragilidade da chave de
identificação disponível para o gênero, baseada em caracteres merísticos pouco
categóricos. Vários caracteres merísticos se mostram sobrepostos para as espécies de
Centropomus, como o número de escamas da linha lateral (e.g. C. undecimalis - 67 a 72
escamas; C. mexicanus - 68 a 78) (Tabela 1). Tal condição torna crítica a identificação
realizada somente por esse método. Diante disto fica evidente a necessidade de outras
abordagens para estimativas de diversidade de espécies no gênero.
A dificuldade de identificação pode ser percebida em levantamentos prévios na
lagoa do Jiqui, onde havia sido identificada a presença exclusiva da espécie C. parallelus
(MORAIS, 2012), amostras que possivelmente diante dos dados aqui levantados,
poderiam incluir exemplares de C. mexicanus e C. undecimalis. De fato, diversos trabalhos
apresentam o C. parallelus com uma distribuição ampla e abundante, principalmente no
sul e sudeste do Brasil, onde tem sido sugerida sua ocorrência exclusiva, juntamente com
C. undecimalis (FIGUEIREDO & MENEZES, 1980; CERQUEIRA, 2002; MORO, 2008).
39
Diferenças locais no registro de ocorrência das espécies de Centropomus podem
indicar distribuições disjuntas ou baixa frequência de ocorrência, dificultando sua
identificação.
As correntes de dispersão costeiras e poucas barreiras ambientais favorecem o
fluxo gênico dessas espécies no Brasil, já que suas larvas e ovos são encontradas em
ambientes próximos a costa (PETERS et al., 1998).
Análises comparativas das populações de C. undecimalis do Caribe e EUA não
apresentaram diferenças genéticas significativas em relação aos indivíduos do Atlântico
Sul, entretanto espécimes restritos ao litoral no Estado do Amapá, próximo ao rio
Amazonas se mostraram geneticamente distintos, indicando uma possível nova espécie
(OLIVEIRA et al., 2014).
A ocorrência de C. mexicanus e aparentemente ausência de C. parallelus no litoral
do Rio Grande do Norte poderia estar relacionada a adaptação da espécie ao clima. Tem
sido sugerido que C. parallelus seria bem adaptada às temperaturas do sul/sudeste do
Brasil (FERRAZ, et al., 2010; COSTA-FILHO et al., 2013). Contudo alguns levantamentos
têm apontado a ocorrência de C. mexicanus no litoral sul brasileiro (SOUSA, 2013), o que
contradiz um diferencial de adaptabilidade a uma destas regiões. Como revelado pela
dificuldade de identificação de espécies de Centropomus ao longo do litoral do Rio
Grande do Norte é provável que o mesmo ocorra em outras áreas do litoral do Brasil,
comprometendo as informações disponíveis sobre o real status de diversidade deste
gênero.
A separação de unidade taxonômica por sequenciamento de DNA se mostrou
resolutiva para as espécies analisadas. A partir dos estudos ora conduzidos, emerge a
necessidade de adequação da chave de identificação para as espécies do gênero
Centropomus. A junção de abordagens morfológicas, genéticas e citogenéticas poderão
trazer subsídios adicionais na identificação das espécies de robalo existentes no litoral
brasileiro contribuindo para seu manejo e conservação.
40
Agradecimentos
Agradecimentos ao CNPq pelo suporte financeiro e ao Programa de Pós-
Graduação em Sistemática e Evolução pelas condições oferecidas a realização do
trabalho.
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46
6. CAPÍTULO 2
Padrões citogenéticos e marcadores citotaxonômicos em duas
espécies de Centropomus da costa nordeste do Brasil
Resumo
Centropomus apresenta seis espécies no Atlântico, cujas características morfológicas
crípticas algumas vezes dificultam a identificação taxonômica. Análises citogenéticas
podem se mostrar eficientes na diferenciação de espécies, embora os dados
cromossômicos das espécies de Centropomus no Atântico Ocidental sejam escassos. No
presente trabalho são apresentadas análises citogenéticas nas espécies C. undecimalis e
C. mexicanus, por meio de técnicas de coloração convencional, bandamento C, Ag-RONs,
coloração com fluorocromos AT- e GC-específicos, bandas de replicação pela
incorporação do análogo de base 5’BrdU (5-bromo-2’-deoxiuridina) e mapeamento
cromossômico in situ de sequências (TTAGGG)n e dos genes RNAr 18S e 5S. Ambas as
espécies exibiram 2n=48 cromossomos acrocêntricos (NF=48). Em ambas espécies os
sítios ribossomais simples (Ag+/18S/MM+), localizados no segundo par cromossômico.
Contudo, em C. undecimalis estes sítios estão localizados em posição terminal no braço
longo, enquanto que em C. mexicanus apresentam um posicionamento pericentromérico.
Os sítios DNAr 5S se aparentam em posição terminal no par 11. Padrões de bandas de
replicação inicial permitiram estabelecer homeologias entre alguns cromossomos das
espécies. O posicionamento dos sítios ribossomais nestas espécies sugere a ocorrência de
uma inversão paracêntrica envolvendo estas regiões. Como em alguns grupos de
Perciformes, as espécies exibem diversas características cromossômicas conservadas.
Contudo, diferem por alterações microestruturais que puderam ser discerníveis pelo
posicionamento diferencial dos sítios ribossomais, que adquirem um caráter
citotaxonômico efetivo na sua identificação. Análises em outras espécies permitirão uma
melhor compreensão do grau de diversificação cariotípica presente nesta família.
Palavras-chave: Citogenética de peixes. Bandamentos cromossômicos. Camurim.
Hibridação in situ.
47
INTRODUÇÃO
A família Centropomidae é dispersa em ambientes de água doce, estuarinos e
marinhos, habitando águas tropicais e subtropicais do Pacífico Oriental e do Atlântico
Ocidental (RIVAS, 1986). Representa um importante recurso na pesca artesanal e
esportiva (ORREL, 2002; XIMENES-CARVALHO, 2006; LI ET AL., 2011) e inúmeras iniciativas
para o cultivo de suas espécies vem se desenvolvendo, apesar de suas limitações diante
do conhecimento sobre fisiologia e biologia reprodutiva de suas espécies (COSTA-FILHO et
al., 2013).
Popularmente conhecidos como robalos ou camurins, são predadores de topo de
cadeia (TAYLOR et al., 2000) alimentando-se principalmente de peixes e crustáceos
(MCMICHAEL et al., 1989). São hermafroditas protândricos (TAYLOR et al., 2000) e sua
desova ocorre em ambiente de alta salinidade, tendo as águas estuarinas seus criadouros
naturais (XIMENES-CARVALHO, 2006).
Apesar da dificuldade na identificação morfológica, os relacionamentos
filogenéticos através de dados moleculares (TRINGALI et al., 1999) são concordantes com
aqueles baseados em dados morfológicos, com algumas exceções (GREENWOOD, 1976).
No litoral do Brasil foram identificadas cinco espécies de Centropomus (GARCIA,
2006), além de uma possível nova espécie presente na região do Oiapoque, extremo
norte do Brasil (OLIVEIRA et al., 2014). Destas espécies, C. undecimalis e C. mexicanus
apresentam ampla distribuição geográfica se estendendo da costa da Flórida, nos Estados
Unidos, passando pelo golfo do México e alcançando quase toda a costa brasileira, com
alguns pontos com ausência de sobreposição (Figura2) (RIVAS, 1986; ORREL, 2002).
Análises citogenéticas tem contribuído para identificar características exclusivas
das espécies, de suas populações e aspectos de sua evolução. Para as espécies da família
Centropomidae os dados existentes são pouco resolutivos e restritos a espécie C.
undecimalis do litoral do México (ARIAS-RODRIGUES et al., 2011). Diante da importância
ecológica e econômica de suas espécies, no presente trabalho foram realizadas análises
citogenéticas a partir de coloração convencional, Ag-RONs, coloração com fluorocromos
AT- e GC-específicos, bandas de replicação pela incorporação do análogo de base 5’BrdU
(5-bromo-2’-deoxiuridina) e mapeamento cromossômico in situ de sequências (TTAGGG)n
48
e dos genes RNAr 18S e 5S, em C. undecimalis e C. mexicanus, espécies com ocorrência
simpátrica no litoral Rio Grande do Norte.
MATERIAL E MÉTODOS
As espécies C. undecimalis e C. mexicanus foram coletadas na Lagoa do Jiqui,
pertencente à bacia hidrográfica do Rio Pitimbu, no município de Parnamirim/RN
(5°55'07,5"S 35°11'17,1"O), em viveiros de uma fazenda de camarão no município de
Arês/RN, na bacia hidrográfica do Rio Jacu (6°12'00,0"S 35°09'14,4"O) e no rio Ceará-
Mirim no município de Extremoz, nas instalações do Centro de Tecnologia em Aquicultura
(CTA-UFRN) (5°41'05,9"S 35°14'26,5"O).
Os espécimes foram submetidos à estimulação mitótica por meio de inoculação
intramuscular in vivo de complexos de antígenos por 24 horas (MOLINA, 2001; MOLINA et
al., 2010). Preparações cromossômicas foram obtidas a partir de fragmentos do rim
anterior, de acordo com a metodologia de obtenção de cromossomos mitóticos in vitro
preconizada por Gold et al. (1990).
Regiões Organizadoras de nucléolos (RONs) foram identificadas utilizando-se
impregnação por nitrato de prata (Ag-RONs) (HOWELL & BLACK, 1980) e as regiões
heterocromáticas pelo bandamento C (SUMMER, 1972). As regiões do DNA ricas em
bases G-C e A-T foram identificadas pela coloração sequencial com os fluorocromos
Mitramicina (MM) e DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (SCHWEIZER, 1980). Padrões de
bandas de replicação foram obtidos a partir da incorporação do análogo de base 5’BrdU
(5-bromo-2’-deoxiuridina) a partir de metodologia desenvolvida por Giles et al. (1988).
Cromossomos mitóticos foram submetidos ao FISH (Fluorescence in situ
hybridization) (PINKEL et al., 1986) usando produtos de PCR dos genes RNAr 5S e 18S
amplificados com os primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’ e B 5’-CAG GCT GGT
ATG GCC GTA AGC-3’ (PENDÁS et al., 1994), NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e NS8
5’-TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3’ (WHITE et al., 1990), respectivamente. O DNAr 18S
foi marcado com DIG-11-dUTP, e sonda DNAr 5S foi marcada com biotina-14-dATP, ambas
por nick-translation (Roche, Mannheim, Alemanha) para análises double-FISH. Sequências
(TTAGGG)n foram mapeadas por FISH usando Telomere PNA FISH Kit/FITC, de acordo com
as instruções do fabricante (DakoCitomation).
49
Foram analisadas cerca de 30 metáfases por espécime. As metáfases mitóticas
foram fotografadas com fotomicroscópio de epifluorescência Olympus BX51 (Olympus,
Tóquio, Japão), através de um sistema de captura de imagem digital Olympus DP73, com
o uso do software CellSens© (Olympus Optical Co. Ltd.).
RESULTADOS
As espécies C. undecimalis e C. mexicanus apresentam um cariótipo com 2n=48
cromossomos, formado exclusivamente por cromossomos acrocêntricos (NF=48) (Figura
6a, b).
Nos cariótipos de C. undecimalis e C. mexicanus os sítios Ag-RONs (MM+/DAPI-),
são coincidentes com constrições secundárias, localizadas em posições diferentes do par
2 (Figura 6a, destaque). Assim, enquanto em C. undecimalis os sítios ribossomais ocupam
a posição terminal do braço longo do segundo par cromossômico, em C. mexicanus estas
regiões ocorrem no mesmo par, porém em posição pericentromérica. Nestas espécies as
regiões heterocromáticas estão distribuídas em posição centromérica dos cromossomos,
bem como nos sítios ribossomais em C. undecimalis e C. mexicanus (Figura 6c).
FISH com sondas DNAr 18S, em C. undecimalis e em C. mexicanus, mostraram
sítios exclusivamente localizados na constrição do par 2. Os sítios DNAr 5S estão
localizados em possíveis pares homeólogos dos pares 11 em posição terminal (Figura 6).
Bandas de replicação inicial permitiram um pareamento mais acurado dos
homólogos sugerindo adicionalmente a ocorrência de padrões homeólogos
interespecíficos. Um padrão de replicação tardia foi observado nas porções
heterocromáticas GC-ricas dos sítios DNAr 18S, diferentemente dos sítios DNAr 5S de
ambas as espécies, que exibiram um padrão de replicação inicial, juntamente com regiões
pericentroméricas de alguns cromossomos (Figura 6e, f). O mapeamento de sequências
teloméricas demonstrou sítios exclusivamente posicionados terminalmente nos
cromossomos de ambas as espécies (Figura 7).
50
Figura 6. Cariótipos de Centropomus undecimalis (a, c, e, g), C. mexicanus (b, d, f, h), com coloração convencional (a, b) e bandamento C (c, d). Padrões de bandas de replicação inicial (e, f). Os quadros destacam a correspondência nos pares organizadores de nucléolos dos sítios Ag-RONs e regiões MM+/DAPI-. Barra = 5µm. Sítios de DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde) identificados por dual-color FISH (g, h).
51
Figura 7. Mapeamento de sequências (TTAGGG)n em metáfases de Centropomus
undecimalis (CUN) (a) e C. mexicanus (CM)(b). Em (c), idiograma do evento de inversão
paracêntrica na divergência evolutiva no par organizador nucleolar das duas espécies.
DISCUSSÃO
Como inúmeras famílias de Perciformes marinhos que apresentam um elevado
grau de conservadorismo cromossômico (MOLINA, 2007; MOTTA-NETO et al., 2012), C.
undecimalis e C. mexicanus compartilham um cariótipo, composto por 2n=48
cromossomos acrocêntricos, com regiões heterocromáticas centroméricas reduzidas, e
sítios Ag-RONs únicos, considerados basais para a Ordem (GALETTI et al., 2000). Estas
características citogenéticas basais, sugerem preliminarmente que algum grau de
conservadorismo cariotípico possa ser extensivo a outros membros da família
Centropomidae.
Sequências repetitivas são importantes componentes genômicos na diferenciação
genética e no processo evolutivo (GREWAL & JIA, 2007; MOLINA, 2007). Assim, baixos
conteúdos heterocromáticos e a presença de sequências repetitivas homogêneas
poderiam constituir condições adversas a altos níveis de reorganização genômica
(MOTTA-NETO et al., 2012). Esse padrão quantitativo e composicional de DNA repetitivo
tem sido identificado em Haemulidae (MOTTA-NETO et al., 2011a, b, 2012), grupo com
cromossomos com baixíssima dinâmica evolutiva, em relação a outras famílias de
Perciformes (MOLINA et al., 2014).
Apesar das duas espécies de Centropomus apresentarem marcada similaridade
cariotípica, diferem por alterações microestruturais perceptíveis entre os pares
organizadores nucleolares. Em ambas as espécies os sítios ribossomais estão presentes
em posições distintas de um par grande, identificado como o par 2.
b a c
CUN CM
52
Similaridades de tamanhos e a presença de sequências DNAr ortólogas apoiam
que os pares organizadores nucleolares sejam homeólogos. Nestes pares cromossômicos
os sítios Ag-RON+/DNAr 18S estão localizados em posição terminal no braço longo em C.
undecimalis e em posição pericentromérica, em C. mexicanus. Como frequentemente
observado em vários grupos de peixes (MOTTA-NETO et al., 2011a; CALADO et al., 2014),
o posicionamento dos sítios DNAr em C. undecimalis e C. mexicanus os tornam
marcadores citotaxonômicos efetivos para essas espécies.
A divergência interespecífica na posição dos sítios ribossomais é possivelmente
derivada de uma inversão paracêntrica. Esse tipo de inversão é de rara detecção em
peixes. Por não alterar a morfologia cromossômica necessita para sua identificação, da
casual inclusão de regiões marcadoras (e.g. sítios ribossomais, segmentos
heterocromáticos) nos segmentos envolvidos.
Em Oncorhynchus mykiss foi identificada a presença em alguns dos indivíduos
polimórficos quanto a uma inversão paracêntrica envolvendo os sítios ribossomais
(OLIVEIRA et al., 1996). A condição homozigota de pares cromossômicos com RONs
duplas estava associada a um efeito letal, não sendo encontrada na prole de
heterozigotos (FORESTI et al., 2004).
Diante da importância funcional desempenhada pelas regiões organizadoras de
nucléolos, a diferença de posicionamento destes sítios nos cromossomos das duas
espécies de Centropomus poderia constituir um possível impedimento reprodutivo entre
elas. De fato, híbridos artificiais entre C. undecimalis e C. parallelus, cujo último possui
cariótipo ainda desconhecido, e é filogeneticamente próxima a C. mexicanus (TRINGALLI
et al., 1999), resulta em uma baixa taxa de sobrevivência (FERRAZ et al., 2013).
Diferentes localizações das regiões organizadoras de nucléolos em C. undecimalis
e C. mexicanus são, portanto, indicativos de reorganização cariotípica (GALETTI et al.,
1991). O mapeamento físico das sequências de DNAr 18S e 5S demonstrou que essas
subunidades ocorrem em cromossomos independentes. Uma localização divergente
entre DNAr 18S e DNAr 5S parece ser a situação mais comum para peixes (MARTINS &
GALETTI, 2001). Tem sido sugerido que o posicionamento distinto das subunidades 45S e
5S seria funcionalmente benéfico (AMARASINGHE & CARLSON, 1998), por serem
transcritas por polimerases distintas. Adicionalmente, sítios DNAr 5S e DNAr 45S não
53
sintênicos, evitariam translocações de sequências nas matrizes DNAr 5S - 45S (MARTINS &
GALETTI, 1999).
Em algumas famílias de peixes ósseos, a heterocromatina associada a
características evolutivas de alguns grupos pode constituir um importante marcador
citotaxonômico (GALETTI et al., 1991; 2000; MARTÍNEZ et al., 1996). Entre os Perciformes,
em geral as regiões heterocromáticas são reduzidas e presentes em regiões
centroméricas e terminais (MOLINA, 2007). Em alguns grupos de espécies tal condição
reduz o uso destas regiões de DNA repetitivo na identificação de eventos evolutivos no
cariótipo, como nas espécies de Centropomus.
Bandas de replicação por aplicação in vivo de 5-BrdU têm auxiliado em análises de
evolução de cariótipos em peixes, dos mecanismos de diversificação de cromossomos
(MAISTRO et al., 1999), da origem e composição de cromossomos sexuais (MOLINA &
GALETTI, 2007), bem como em comparações de espécies estritamente relacionadas
(HELLMER et al., 1991; MOTTA NETO et al., 2012).
Em cariótipos Perciformes-like, como exibido pelas duas espécies de Centropomus,
com poucos pares ou regiões cromossômicas espécie-específicas, o pareamento de
homólogos e detecção de homeologias interespecíficas podem ser otimizadas pelo uso de
bandas de replicação. Nos padrões de replicação produzidos pela incorporação do
análogo de base 5-BrdU, nos cromossomos de C. undecimalis e C. mexicanus, áreas
escuras correspondem a regiões de DNA com replicação inicial, enquanto áreas claras
indicam regiões com replicação tardia.
Padrões longitudinais de replicação foram encontrados em alguns dos
cromossomos das espécies analisadas. Regiões de replicação inicial foram observadas nas
regiões centroméricas da maioria dos pares cromossômicos, além de posições terminais
em alguns pares de cromossomos, incluindo os sítios DNAr 5S. Regiões de replicação
tardia foram particularmente evidentes nos sítios ribossomais e em regiões
pericentroméricas de alguns cromossomos. O conjunto de bandas longitudinais
produzido, permitiu identificar homeologias entre pares cromossômicos das duas
espécies.
No Atlântico, a barreira do rio Amazonas encontra-se inserida na distribuição das
espécies de Centropomus. Sua ação se iniciou há acerca de 11 m.a. (ROCHA, 2003),
influenciando a diversificação das faunas entre o Caribe e o Atlântico Sul, embora sua
54
ação se mostre permeável a alguns grupos de peixes (FLOETER et al., 2008). Suas
interferências sobre as espécies de Centropomus poderia ser pouco efetiva diante da
característica diádroma das espécies. Embora os padrões macroestruturais dos
cromossomos de uma população de C. undecimalis da costa do México (ARIAS-
RODRIGUEZ et al., 2011) se mostrem similares a obtida para a espécie no litoral nordeste
brasileiro, análises citogenéticas mais aprofundadas serão necessárias para confirmar a
homogeneidade cariotípica entre essas regiões.
As alterações cariotípicas entre C. undecimalis e C. mexicanus se mostram
reduzidas frente a uma divergência estimada em 23 m.a entre estas espécies (OLIVEIRA et
al., 2014). Análises adicionais de mapeamento de sequências repetitivas, nestas e em
outras espécies, poderão estimar o grau de mudanças cromossômicas microestruturais
estabelecidas durante o processo evolutivo do gênero Centropomus.
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos ao CNPq pelo suporte financeiro e ao Programa de Pós-
Graduação em Sistemática e Evolução pelas condições oferecidas a realização do
trabalho.
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