EVOLUO DA PCR AMANDA FRAGA

PCR (REAO EM CADEIA DA POLIMERASE)Histrico:

- Proposto por Saiki & col. (1985).E por Kary Mullis & col. (1987). Prmio Nobel de Qumica em 1993.

- DNA polimerase isolada de uma bactria termoflica Thermos aquatics (Taq). - Em 1989 desenvolvido o 1 Termociclador o DNA THERMAL CYCLER.

PRIMERs

Deoxinucleotdeos (dNTP) ATP,TTP,CTP,GTP

DNA Polimerase TAQ POLIMERASE

TAMPO

ADITIVOS

MgCl2

ELETROFORESE

PCR HOT START

DNA polimerase podem demonstrar uma pequena atividade temperatura ambiente, durante a montagem do experimento.Essa in/eficiente atividade pode catalisar a extenso de qualquer extremidade 3 anelada.Atividade exonuclease 5-3 degrada qualquer extremidade 5 parcialmente anelada, destruindo o primer e o substrato molde.Anelamento inespecfico de primers e templates (fita molde).Variao da PCR onde a reao de amplificao iniciada a altas temperaturas

Modificao da PCR convencional, que pode resultar na diminuio de amplificaes no-especficas.Temperatura de anelamento:Inicialmente mais alta que a temperatura tima dos primers;Diminuio de 1C a cada um ou dois ciclos, at atingir temperatura especfica;Aps atingir temperatura especfica (touchdown), ela mantida nos ciclos restantes.

PCR TOUCHDOWN95 30s95 30s, 60 30s, 72 1min (3 ciclos)95 30s, 56 30s, 72 1min (3 ciclos)95 30s, 53 30s, 72 1min (3 ciclos)95 30s, 50 30s, 72 1min (25 ciclos)72 5 min4 forever

PCR ALELO ESPECFICO PCR 1 (primer S)PCR 2 (primer M)DNA genmico indivduo ADNA genmico indivduo B

Na dcada de 60 pesquisadores descobriram que bactrias possuiam enzimas que cortam e digerem o DNA protegendo assim a clula bacteriana de invasores.

A tcnica de RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorfism ) que utiliza enzimas de restrio para digerir os produtos amplificados numa PCR. A digesto do produto pode revelar alteraes nos stios de restrio das enzimas utilizadas.

A base gentica do polimorfismo observado resulta de mutaes nos stios de restrio ou de inseres, delees e rearranjos entre estes stios.

PCR-RFLP (POLIMORFISMO DO TAMANHO DO FRAGMENTO DE RESTRIO)

PCR-RFLP

PCR-RFLPVariabilidade gentica.Identificao de espcies.Mapeamento genmico.Anlise de doenas genticas.

PCR - NESTEDTcnica que utiliza como molde o produto amplificado numa primeira PCR. Neste caso um produto amplificado reamplificado a partir de primers que se hibridizam no interior do produto da primeira reao. So utilizados dois pares de primers (ao invs de um), para amplificar um mesmo fragmento.Usado no diagnstico.

Possue duas etapas de PCR s que estas so realizadas separadamente. O produto do 1round utilizado como template no 2round. No final das duas etapas, obtem-se um produto menor que o da primeira amplificao.Aumenta a especificidade e a eficincia, uma vez que, o DNA-molde do 2round est em concentraes altssimas e os primers da segunda etapa tem menos chances de anelamento em sequncias inespecficas. PCR SEMI NESTED

PCR - MULTIPLEXReao de amplificao com dois ou mais conjuntos de primers desenhado para detectar mltiplas sequncias alvo numa mesma amostra.Usado na investigao de paternidade, onde vrios marcadores genmicos so analisados.Anlise de vrios xons.

PCR SSCP (POLIMORFISMO DE CONFORMAO DE FILAMENTO NICO)Esquema do mtodo de SSCP, mostrando que diferentes seqncias podem apresentar conformaes especficas possibilitando a identificao de diferentes alelos quando submetidos a uma corrida eletrofortica.Descrito por Oriata et al., 1989.Baseia-se no fato de que a conformao tridimensional de fragmentos de DNA simples-fita depende da sequncia de nucleotdeos, sendo que a diferena de um nucleotdeo altera o padro de migrao eletrofortica.

A sensibilidade do SSCP mais afetada pela posio da mutao e da sequncia que a flanqueia do que pelo tipo de mutao.A sensibilidade do SSCP decresce com o aumento do tamanho do fragmento.PCR SSCP (POLIMORFISMO DE CONFORMAO DE FILAMENTO NICO)

PCR SSP (SEQUNCIA DE INICIADORES ESPECFICOS )Utiliza uma sequncia de iniciadores especficos para tipagem tecidular a partir do DNA.Os iniciadores especficos de alelo e/ou de grupos de alelos e um par de iniciadores de controle que corresponde s sequncias no allicas da amostra.O iniciador que corresponda com perfeio ser utilizado com mais eficincia na reao da PCR do que um iniciador que possua uma ou vrias correspondncias deficientes na sua cadeia de extremidade 3.Cada par de iniciador identifica dois locais polimrficos, de localizao de cis, ligados.Usado na anlise do sistema HLA

PCR ento conduzido para determinar se a colnia contm o fragmento de DNA ou plasmdeo de interesse. PCR COLONY (DE COLNIAS)

PCR que ocorre dentro da clula em uma lmina. Pode ser realizada em clulas ou tecidos fixados.PCR IN SITU

Limitao da PCR convencional: as regies 5 e 3 que flanqueiam seu fragmento de DNA de interesse devem ser conhecidas.Inverse PCR permite a PCR quando voc possui informao de apenas uma sequncia interna.Sequenciamento de uma regio no conhecida; vrios primers de espcies prximas.PCR INVERSA

PCR cuja extenso mais longa que as PCR convencionais (acima de 5Kb).Para obteno de uma alta preciso mistura-se polimerases especficas.Exemplo: Proficient polymerase + Accurate polymerase (Pfu)

PCR LONG

o mtodo desenvolvido para superar as dificuldades na quantificao por PCR.Densiometria imagem e usado para deteco de doenas virais.Adiciona-se a reao,uma quantidade conhecida do fragmento de DNA (competidor). Esse competidor deve conter sequncias para os mesmos primers utilizados para amplificar o alvo.

PCR COMPETITIVE

Primers degenerados primers que possuem um nmero de opes em vrias posies na sequncia.Estudos de citogentica molecular.

Exemplos:5-TCG AAT TCV CCY AAY TGR CCN T-35-TCB AAT TCG CHC AAA TKA CCG T-3

PCR DEGENERATE OU DOP

Uma PCR quantitativa que mede a quantidade de DNA ou de RNAmensageiro (RNAm) em uma amostra.

Usa-se corantes fluorescentes que so intercalados ao DNA, como o SYBR-Green I, os quais unem de forma no especifica as fitas de DNA formando fitas duplas durante o processo de amplificao.

Determinar a expresso do RNAm de um gene, e comparar amostras controles e amostras pacientes em uma determinada doena dando uma idia das alteraes na expresso durante a patognese e a deteco do patgeno no sangue.

PCR REAL TIME

RT PCR (TRANSCRIO REVERSA E REAO EM CADEIA DA POLIMERASE)1passo: Isolar o RNAm da clula ou tecido em questo atravs da incubao com a enzima transcriptase reversa (RT) atravs desta ocorre a sntese de cDNA.2passo: Hidrlise da fita de cDNA.3passo: Realizao da PCR a partir do cDNA onde utilizada a DNA polimerase para a amplicao do fragmento.

Clonagem de um cDNA.O fragmento corresponde ao gene de interesse s ser amplificado nas clulas ou tecidos onde esse gene expresso.RT- PCR

Utiliza primers mais curtos e de sequncia arbitrria para dirigir a reao de amplificao, eliminando a necessidade do conhecimento prvio de sequncia.Usa apenas um prime ao invs de um par de primers.As duas sequncias de DNA complementares ao primer arbritrio devem estar suficientemente adjacentes e em orientao oposta. RAPD (DNA POLIMRFICO AMPLIFICADO ALEATORIAMENTE) OU AP-PCR (ARBITRARILY PRIMED-POLYMERASE CHAIN REACTION)

Uso dos marcadores RAPD:_ obteno de fingerprints ( impresses digitais ) genmicos de indivduos, variedades e populaes;_ anlise da estrutura e diversidade gentica em populaes naturais e populaes de melhoramento;_ estabelecimento de relacionamentos filogenticos entre diferentes espcies;_ construo de mapas genticos de alta cobertura genmica e a localizao de genes de interesse econmico.

AP- PCR ou RAPD

a tecnologia mais recente para obteno de um grande nmero de marcadores moleculares distribudos em genomas de eucariotos e procariotos.O DNA genmico do indivduo clivado com duas enzimas de restrio.Adaptadores especficos so ligados aos terminais dos fragmentos genmicos gerados pela clivagem.

Visualizao em gel de alta resoluoAFLP ( POLIMORFISMO DO TAMANHO DE FRAGMENTOS AMPLIFICADOS)

Uma frao dos fragmentos gerados amplificado seletivamente via PCR utilizando primers especficos, desenhados para reconhecer sequncias nos adaptadores . Uma ao seletiva ocorre portanto no momento que realizada a PCR e somente uma subpopulao de fragmentos amplificada.

AFLP

O polimorfismo de marcadores AFLP depende da relao entre o nmero de nucleotdeos seletivos nos primes da PCR e a complexidade do genoma.So utilizados primers bem mais longos, o que aumenta a especificidade da amplificao.

AFLP

um processo que determina a ordem dos nucleotdeos (blocos que constituem a molcula de DNA) em uma amostra.Utilizado o chamado mtodo didesoxi conhecido tambm como de terminadores de cadeia ou de Sanger. Consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo, o ltimo nucleotdeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia.

SEQUENCIAMENTO

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