allan jonathan chernichiarro corrÊa · cumarinas presentes nos extratos brutos e frações...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ALLAN JONATHAN CHERNICHIARRO CORRÊA

ANÁLISE COMPARATIVA DE ATIVIDADES ANTIMICROBIANA E CITOTÓXICA DE EXTRATOS BRUTOS E FRAÇÕES DO RIZOMA DE ALPINIA ZERUMBET

(PERS.) B.L. BURTT. & R.M. SM. COM TRÊS CUMARINAS SINTÉTICAS

Recife

2014

i




Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.

Orientadora: Profª Drª Silene Carneiro do Nascimento

Co-Orientadora: Profª Drª Maria do Carmo de Caldas Dias Costa

Recife

2014

ii

Catalogação na Fonte: Bibliotecário Bruno Márcio Gouveia, CRB-4/1788

Corrêa, Allan Jonathan Chernichiarro

Análise comparativa de atividades antimicrobiana e citotóxica de extratos brutos e frações do rizoma de Alpinia Zerumbet (PERS.) B.L. BURTT. & R.M. SM. com três cumarinas sintéticas / Allan Jonathan Cherbichiarro Corrêa. – Recife: O Autor, 2014. 87 folhas: il.

Orientadora: Silene Carneiro do Nascimento, Maria do Carmo de Caldas Dias Costa Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de

Ciências Biológicas. Pós-graduação em Ciências Biológicas, 2014.

Inclui bibliografia e anexos

1. Plantas medicinais I. Nascimento, Silene Carneiro do (orient.) II.

Costa, Maria do Carmo de Caldas Dias (coorient.) III. Título.

581.634 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2014-141

iii

Parecer da banca examinadora da defesa da dissertação do aluno




Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.

A comissão examinadora, composta pelos professores abaixo, sob a presidência da

primeira, considera o candidato ALLAN JONATHAN CHERNICHIARRO CORREA

como:

____ APROVADO___________

Recife, 28 de fevereiro de 2012

_____________________________________________

Profª. Drª. Silene Carneiro do Nascimento Departamento de Antibióticos, UFPE (orientadora)

_____________________________________________

Prof. Dr. Sebastião José de Melo Departamento de Antibióticos, UFPE

_____________________________________________

Profª. Drª. Teresinha Gonçalves da Silva Departamento de Antibióticos, UFPE

iv

“A ignorância gera confiança com mais

frequência do que o conhecimento: são

aqueles que sabem pouco, e não

aqueles que sabem muito, que tão

positivamente afirmam que esse ou

aquele problema jamais será resolvido

pela ciência.”

Charles Darwin

v

AGRADECIMENTO

Agradeço primeiramente a Deus, pois sempre me deu calma, discernimento e autocontrole para lidar com a vida.

A minha mãe, Rachel Chernichiarro Corrêa, pela força que sempre me deu em todos os momentos que precisei, por sempre estar comigo e por me amar incondicionalmente.

Ao meu irmão, Leonardo Chernichiarro Corrêa, por ser uma figura masculina para mim e que conto em todos os momentos.

A minha irmã, Rosana Chernichiarro Corrêa, que confia, acredita e torce por mim.

A minha orientadora, Silene Carneiro Nascimento, por ter acreditado em mim, um aluno de outra instituição e mesmo assim ter confiado em minha capacidade.

A minha co-orientadora, Maria do Carmo de Caldas Dias Costa, por ter sido mais que uma orientadora, na verdade uma mãe científica a quem tenho um carinho enorme. Uma grande mulher!

A Glaucia Araújo Azevedo, pelos momentos de lucidez ao meu lado, amor e carinho que lhe foram peculiares.

Ao pessoal do LAPRONAT, Tadeu Peixoto Sobrinho, Valerium Castro, Jenifer Oliveira, Thiago Caruaru, Joabe Melo pelos momentos de união e companheirismos que passamos neste laboratório e principalmente quero agradecer a Daniela Cabral, pessoa a qual eu gosto muito e foi primordial nos momentos em que me senti sozinho e desestimulado.

Aos amigos mais próximos, Vitor Coutinho, Isaac Luz, Luiz Damasceno, Pericles Miranda, Klayson Zamorano, Filipe Augusto, Claudio e Lucimary Queiroga, pois vocês sempre estão comigo nós momentos principais de minha vida, tanto nos bons, quanto nos ruins.

Aos amigos que conheci pelo mestrado, como Marek Ekert, Rafael Lira, João Scavuzzi, Igor Souza, Afonso Agra e Rosilma Oliveira, pelos momentos importantes e de pura “intelectualidade” que passamos nos seminários da vida, sem esquecer-se de noites na casa de Afonso...

Gostaria de agradecer muito a professores que são importantíssimos em minha formação acadêmica e científica, como Profª Kêsia Xistos, Profº Mauricio Santos, Profº Sebastião Melo, Profª Terezinha Silva e principalmente Profª Elba Amorim, que abriu seu laboratório para mim e deu uma força imensa nesta dissertação com orientações e conselhos em momentos de dificuldade e desestímulo.

Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco e a CAPES pela oportunidade e financiamento da bolsa.

Obrigado!

vi

RESUMO

Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. planta originária da Ásia, pertence a família Zingiberaceae e é freqüentemente usada pela população como antihihipertensiva, diurética e antitérmica. A espécie possui em sua composição química metabólitos como terpenos, flavonóides e cumarinas. As cumarinas, objeto de estudo comparativo neste trabalho, possuem propriedades antimicrobiana, anti-inflamatória e antioxidante comprovadas, como também um grande potencial tóxico para o fígado, a pele e mucosas. Devido a sua toxidez, o uso de cumarina por via oral foi restringido ou suspenso em diversos países tais como Australia, Belgica e Estados Unidos. O intenso uso de A. zerumbet motivou o estudo comparativo entre as atividades biológicas da espécie relacionando-as com as quantidades de cumarinas presentes nos extratos brutos e frações produzidas a partir do rizoma da planta coletada no Laboratório de Fitoterapia – IPA. As cumarinas utilizadas como padrão foram a 1,2-benzopirona, a cianocumarina e a cumarina ácida. A primeira foi adquirida da Sigma-Aldrich e as demais foram sintetizadas a partir da malononitrila e salicialaldeido. Os extratos brutos e frações foram produzidos com solventes de diferentes polaridades. As ações antimicrobianas e citotóxicas foram comparadas com as atividades obtidas para as três cumarinas testes e relacionadas ao teor de cumarinas presentes nos extratos brutos e frações. As extrações foram realizadas por decocção, turbólise, soxhlet e maceração, sendo este último, o melhor método para extração de cumarinas. A presença de cumarinas foi determinada por Cromatografia em Camada Delgada - CCD e a quantificação nos extratos e frações foram realizadas por espectrofotometria. A avaliação da atividade antimicrobiana foi feita pelo método de difusão em ágar (disco) frente a nove microrganismos testes da coleção de microrganismo do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. A atividade citotóxica foi avaliada pelo método do MTT frente três linhagens celulares. Os resultados mostram que tanto a atividade antimicrobiana como a atividade citotóxica de todos os extratos e frações se mostraram mais ativos quanto maiores os teores de cumarina neles presentes. Os microrganismos mais sensíveis foram os gram-positivos, álcool-ácido resistente e a levedura C. albicans. Nos testes de atividade citotóxica as linhagens mais sensíveis aos extratos foram as linhagens HT-29 e NCI-H292. Podemos concluir que houve correlação entre a presença de cumarina e a ação antimicrobiana e citotóxica dos extratos brutos e frações, porem, essa correlação foi mais acentuada para os ensaios de citotoxicidade. Isto sugere que a ingestão oral e uso tópico da A. zerumbet, tal como é feito pela população, não está isenta de risco mesmo considerando que a presença de cumarina foi maior nos extratos produzidos com solventes de polaridade moderada.

PALAVRAS-CHAVE: atividade antimicrobiana, Alpinia zerumbet, cumarinas, atividade citotóxica

vii

ABSTRACT Alpinia zerumbet (Pers.) BL Burtt & RM Sm native plant to Asia, belongs to Zingiberaceae family and is often used by the population as antihypertensive, diuretic and antipyretic. The species has in its chemical composition metabolites such as terpenes, flavonoids and coumarins. Coumarins, the object of comparative study in this work have antimicrobial, antiinflammatory and antioxidant properties proven, but also a high toxic potential to the liver, skin and mucous membrane. Due to its toxicity, the use of coumarin was orally suspended or restricted in many countries such as Australia, Belgium and the United States. The intense use of A. zerumbet motivated the comparative study of the biological activities of the species relating them with the amounts of coumarin present in crude extracts and fractions produced from the plant rhizome collected at the Laboratory of Herbal Medicine-IPA. The coumarins used as standard were 1.2-benzopyrone, cianocoumarin acid and coumarin. The first was purchased from Sigma-Aldrich and others were synthesized from malononitrila and salicialaldeido (Sigma-Aldrich). The extracts and fractions were produced with solvents with different polarities. The antimicrobial and cytotoxic activities were compared to the activities obtained from the three tests coumarins and related content coumarins present in crude extracts and fractions. The extractions were performed by decoction, turbólise, soxhlet and maceration, the latter being the best method for extraction coumarins. The coumarins presence was determined by thin layer chromatography-TLC and quantification in extracts and fractions were performed by spectrophotometry. Evaluation of the antimicrobial activity was performed by the agar diffusion method (disc) against nine test microorganisms of microorganism collection of Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco. The cytotoxic activity was evaluated by the MTT method against three cell lines. The results show that both antimicrobial activity and cytotoxic activity of all extracts and fractions were more active as higher the levels of coumarin present in them. The most sensitive microorganisms were gram-positive and acid- resistant C. albicans yeast. In the cytotoxicity tests the most sensitive strains to the extracts were HT - 29 and NCI- H292 strains. We can conclude that there was a correlation between the presence of coumarin and antimicrobial and cytotoxic activity of extracts and fractions, however, this correlation was more pronounced for the cytotoxicity assays. This suggests that oral intake and topical use of A. zerumbet, as is done by the population, is not without risk even considering that the presence of coumarin was higher in extracts produced with solvents of moderate polarity.

KEY WORDS: antimicrobial activity, Alpinia zerumbet, coumarins, cytotoxic activity

viii

LISTA DE FIGURAS REVISÃO DE LITERATURA / MATERIAIS E MÉTODOS

FIGURA 1 – Aspecto geral da Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt. & R. M. Sm.

cultivada no Laboratório de Fitoterapia do IPA............................................16

FIGURA 2 – Esquema reacional das etapas de reação para Cianocumarina e

Cumarina Ácida................................................................................28

ARTIGO 1


Cumarina Ácida................................................................................49

FIGURA 2 – Placa cromatográfica para identificação de presença de cumarina nos extratos e frações obitdos de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M.

Sm...............................................................................................49

FIGURA 3 - Curva de calibração da solução padrão de cumarina, com leitura em

320 nm. Os valores são referentes à tabela 3.............................................50

FIGURA 4 – Foto do teste de disco da atividade antifúngica de frações do extrato de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt. & R.M. Sm. coletados em período chuvoso frente

a Candida albicans............................................................................50

ARTIGO 2


Cumarina Ácida...............................................................................56

FIGURA 2 – Placa cromatográfica para identificação de presença de cumarina nos extratos e frações obitdos de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M.

Sm..............................................................................................61

FIGURA 3 - Curva de calibração da solução padrão de cumarina, com leitura em

320 nm. Os valores são referentes à tabela 3.............................................61

ix

LISTA DE TABELAS REVISÃO DE LITERATURA / MATERIAIS E MÉTODOS

TABELA 1. Constituintes químicos citados para folhas e rizoma de Alpinia zerumbet

(Pers.) B. L. Burtt. & R. M. Sm. no período revisado (1973-2011)......................18

TABELA 2. Constituintes químicos citados para Flores, Sementes e Óleos essenciais de Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt. & R. M. Sm. para o período

revisado (1973-2011).........................................................................19

TABELA 3. Efeitos farmacológicos descritos para diferentes partes de Alpinia

zerumbet (Pers.) B. L. Burtt. & R. M. Sm. no período revisado (1973-2011)..........22

TABELA 4 – Metodologia de extração do rizoma de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L.

Burtt & R.M. Sm. por maceração, decocção, turbólise e soxhlet.......................29

TABELA 5 – Reagentes utilizados no método de identificação de cumarinas por cromatografia em camada delgada utilizando esculetina, 1,2-benzopirona e cumarina

ácida como padrões. (MARKHAM, 1982 e WAGNER, 1984)...........................30

ARTIGO 1

TABELA 1 – Presença e teores de cumarinas por Cromatografia em Camada Delgada e doseamento por espectrofotometria nos extratos e frações secos obtidos

do rizoma de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm............................51

TABELA 2 – Alíquotas utilizadas para formar a curva de calibração com solução

padrão de cumarina...........................................................................51

TABELA 3 – Comparação da atividade antimicrobiana de extratos brutos e frações de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt. & R.M. Sm. obtidos por maceração com

cumarinas sintéticas..........................................................................52

TABELA 4 – Comparação da atividade antimicrobiana de extratos brutos de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt. & R.M. Sm. obtidos por decocção, tubólise e soxhlet com

cumarinas sintéticas..........................................................................53

x

ARTIGO 2

TABELA 1 – Metodologia de extração do rizoma de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L.

Burtt & R.M. Sm. por maceração, decocção, turbólise e soxhlet.......................57

TABELA 2 – Reagentes utilizados no método de identificação de cumarinas por cromatografia em camada delgada utilizando esculetina, 1,2-benzopirona e cumarina

ácida como padrões. (MARKHAM, 1982 e WAGNER, 1984)...........................58

TABELA 3 – Alíquotas utilizadas para formar a curva de calibração com solução

padrão de cumarina..........................................................................62

TABELA 4 – Presença e teores de cumarinas por Cromatografia em Camada Delgada e doseamento por espectrofotometria nos extratos e frações secos obtidos

do rizoma de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm............................62

TABELA 5 – Percentual de Inibição obtido para extratos brutos e frações de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. obtidos por maceração frente a linhagens

celulares........................................................................................64

TABELA 6 – Percentual de Inibição obtido para extratos brutos de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. obtidos por decocção, turbólise e soxhlet frente a

linhagens celulares............................................................................65

xi

LISTA DE ABREVIAÇÕES CAP - Potencial de ação composto

CCD - Cromatografia em camada delgada

CMI - Concentração Minima Inibitótia

DK - 5,6-dihidrokavaina

DDK - dihidro-5,6-dihidrokavaina

DMSO - Dimetilsulfóxido

DPPH - 1.1-difenil-2-picrilhidrazil

FDA - United States Food and Drug Administration

GC-MS - Cromatógrafo gasoso acoplado a Espectrometro de massa

HClconc – Ácido Clorídrico concentrado

KCl - Cloreto de potassio

LVM - Leito vascular mesentérico

MRSA - Staphylococcus aureus meticilina resistente

MTT - Brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio

EICM - Escritório Intercontinental de controle de medicamentos

SUS - Sistema Único de Saúde

TOPS-MODE - Modelos topológicos substruturais Moleculares

xii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 12

2 REVISÃO DE LITERATURA 15

2.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE Alpinia zerumbet (PERS.) B.L. BURTT. &

R.M. SM 15

2.1.1 Composição química 16

2.1.2 Aspectos farmacológicos 20

2.1.3 Efeitos tóxicos de A. zerumbet 23

2.2 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE AS CUMARINAS 23

2.2.1 Ações farmacológicas de cumarinas 24

2.2.2 Efeitos tóxicos da cumarina 26

3 MATERIAIS E MÉTODOS 27

3.1 SÍNTESE DE DERIVADOS CUMARÍNICOS 27

3.2 COLETA VEGETAL E PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS 28

3.3 ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO 29

3.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA 30

3.5 ATIVIDADE CITOTÓXICA 31

4 RESULTADOS 33

4.1 ARTIGO 1 33

4.2 ARTIGO 2 54

5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 71

REFERÊNCIAS 72

ANEXO A - NORMAS DE PUBLICAÇÃO DA REVISTA QUÍMICA

NOVA 82

12

1 INTRODUÇÃO

O uso de plantas medicinais em nosso país sofreu influência de várias

culturas, como a dos colonizadores europeus, dos africanos e principalmente dos

indígenas. O interesse e o conhecimento dedicado às plantas e seus princípios

terapêuticos hoje é muito maior, pois diante das carências financeiras, torna-se uma

alternativa viável para uma grande parte da população brasileira. O estudo das

plantas originou as práticas fitoterápicas e posteriormente a Fitoterapia como

Ciência (ALBUQUERQUE; ANDRADE, 1990).

No Brasil 20% da população consome medicamentos industrializados e

80 % encontra nos produtos de origem natural, especialmente nas plantas

medicinais, a única fonte de recurso terapêutico. Ainda hoje nas regiões mais pobres

do país e até mesmo nas grandes cidades brasileiras, plantas medicinais são

comercializadas em feiras livres, mercados populares e encontradas nos quintais

residenciais (DI STASI, 1996; MACIEL et al, 2002).

Apesar da riqueza da flora brasileira e da ampla utilização de plantas

medicinais pela população, existe consenso sobre a insuficiência de estudos

científicos envolvendo plantas medicinais. Os medicamentos fitoterápicos e as

plantas medicinais possuem um papel de destaque no sistema brasileiro de saúde,

tanto do ponto de vista econômico como cultural. O Brasil carece de informações

científicas confiáveis que contribuam para o preenchimento do conceito moderno de

medicamento, que deve considerar a eficácia, segurança e constância de qualidade

(PETROVICK, 1997).

A área de pesquisa que envolve o estudo de plantas medicinais tem um

ponto crucial que é a química dos produtos naturais. Os métodos empregados nessa

área proporcionam o isolamento e a purificação de novas moléculas, que pode

culminar com a correta determinação estrutural até, finalmente, a síntese total ao

parcial do novo composto descrito (DI STASI, 1996).

A química e a farmacologia, ciências que podem ser consideradas

interdisciplinares, constituem um dos principais fatores para a descoberta de

princípios ativos naturais. Essa estreita colaboração promove rapidez e consistência

em se tratando de alcançar um objetivo (FILHO; YUNES, 2001).

Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt. & R.M. Sm. é uma planta exótica

originária da Ásia e amplamente cultivada no Nordeste brasileiro. Levemente

13

aromática, além de ornamental, a espécie se destaca pelo seu uso popular como

anti-hipertensiva, diurética e antitérmica (ALMEIDA, 1993; LORENZI; SOUZA, 1995).

Alguns estudos já comprovaram suas ações hipotensora e diurética (MENDONÇA et

al. 1991; LARANJA et al. 1991 e 1992; EMILIANO, 2002;), como também suas

propriedades antimicrobiana e citotóxica (WATTIEZ; STERNON, 1942; SA et al.

1994; VORAVUTHIKUNCHAI et al. 2005; WANG; HUANG, 2005; ELZAAWELY;

XUAN; TAWATA, 2007; COSTA et al. 2007, 2008, CORRÊA et al. 2009), além de

propriedades anti-histéricas, estomáquicas e vermífugas (ALMEIDA, 1993).

Estudos fitoquímicos elucidaram sua composição química mostrando a

presença de compostos terpenóides, flavônicos e cumarínicos em suas folhas,

flores, rizoma e sementes (MPALANTINOS et al. 1998; ZOGHBI et al. 1999).

Destaca-se que as cumarinas possuem ações antioxidante, anti-inflamatória e

antimicrobriana já comprovadas (TORRES et al. 2006; KALKHAMBKAR et al. 2008;

MENGHINI et al. 2010), sendo utilizadas na indústria alimentícia como flavorizantes,

uso este, que vêm sendo combatido, devido sua alta toxicidade que motivou a

proibição do seu uso farmacêutico e alimentício em vários países (COUMARIN,

2006; ARAUJO; ECHEVERRIA; PASTORE-JUNIOR, 2004).

Recentemente o Mistério da Saúde incluiu a espécie na Relação Nacional

de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS) (BRASIL, 2009). Porém

ressalta-se que o FDA desde 1954 proibiu a o uso de cumarinas em alimentos para

seres humanos e a sua importação, o SCF (Scientific Comitte for Food) dos Estados

Unidos após pesquisar a toxidez da cumarina em 1994, concluíram que a cumarina

foi carcinogênica para ratos quando ingerida. Por outro lado, no Brasil, o Decreto

número 50.040, de 24 de janeiro de 1961 que dispões sobre as normas técnicas

especiais reguladoras do emprego de aditivos químicos a alimentos, proibiu a adição

de cumarinas aos flavorizantes por esta ser considerada uma substância prejudicial

à saúde e a Grande Farmacopéia Brasileira indica a dose de 500 mg/dia como dose

máxima para adultos (ARAUJO; ECHEVERRIA; PASTORE-JUNIOR, 2004).

Devido ao grande uso popular de A. zerumbet, apontada como uma das

mais citadas por usuários do SUS de Cuiaba-Mt (BIESKI, 2005) e entre as dez

plantas mais comercializadas nos mercados públicos da Região Metropolitana

Recife (ALBUQUERQUE et al. 2007) e a sua inclusão como Planta Medicinal de

Interesse ao SUS feita pelo Ministério da Saúde do Brasil em 2009, objetivou-se

neste estudo, comprovar a presença de cumarina na espécie, avaliar a existência

14

de uma correlação entre suas atividades biológicas e os teores de cumarinas

presentes nos extratos brutos e frações testadas, visando alertar a comunidade

cientifica e a população em geral para os possíveis riscos decorrentes do uso

indiscriminado da planta, principalmente na forma de chás e banhos.

O presente trabalho tem por objetivo comparar as atividades

antimicrobiana e citotóxica da Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. com as

ações de três cumarinas sintéticas, relacionando o grau destas atividades com os

teores de cumarinas presentes nos extratos brutos e frações.

Tentando elucidar este objetivo, buscou-se sintetizar dois compostos

cumarínicos a partir da malononitrila e salicilaldeido para serem utilizados como

padrões nas análises comparativas das atividades antimicrobiana e citotóxica,

produzir extratos brutos e frações a partir do rizoma de A. zerumbet utilizando

solventes de diferentes polaridades, para avaliação de atividades antimicrobiana e

citotóxica, identificar por Cromatografia em Camada Delgada a presença de

cumarina nos extratos brutos e frações testes, dosar cumarinas presente nos

extratos brutos e frações através de espectrofotometria, comparar e relacionar a

atividade antimicrobiana e citotóxica dos extratos brutos e frações com os teores de

cumarinas presentes e com as cumarinas sintéticas utilizadas como padrões.

15

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE Alpinia zerumbet (PERS.) B.L. BURTT. & R.M. SM.

Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt. & R.M. Sm, pertence à família

Zingiberaceae e é citada com as seguintes sinonímias: Alpinia speciosa K. Shum,

Costus zerumbet Pers., Languas speciosa Small e Zerumbet speciosum J. C.

Wendel (LORENZI; SOUZA, 2001).

A espécie trazida para o Brasil no século XIX pelo imperador D. Pedro I

para ser cultivada no Jardim Botânico do Rio de Janeiro, onde recebeu o nome de

flor-da-redenção e bastão-do-imperador (CORRÊA, 1975; ALMEIDA, 1993;

LORENZI; SOUZA, 1995).

É uma planta herbácea, perene, que atinge 2 a 3 metros de altura,

rizomatosa, com pseudocaule aéreo curto, originado pela sobreposição das bainhas

(Figura 1). As folhas são coreáceas, espessas e lanceoladas em disposição dística,

curto-pecioladas, pontudas, verde-luzidias, com bainha aberta e língula

desenvolvida. Na forma “variegata”, as folhas possuem estrias branco-amareladas,

de grande efeito decorativo. Flores ligeiramente aromáticas, dispostas em cachos

grandes, de cálice branco e corola branco-rosada, formados principalmente no verão

e outono. Cultivada como touceira isolada, em grupos e renques, a pleno sol na

forma típica e a meia-sombra na variegada, em canteiros ricos em matéria orgânica

e irrigados periodicamente. Não tolera geada e multiplica-se por divisão de touceira

em qualquer época do ano (ALMEIDA, 1993; LORENZI; SOUZA, 2001).

16

FIGURA 1 – Aspecto geral da Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt. & R. M. Sm. cultivada no Laboratório de Fitoterapia do IPA.

2.1.1 Composição química

Ainda existe uma grande lacuna quando se trata do estudo da

composição química de espécies vegetais, principalmente no caso de plantas

encontradas nas florestas tropicais. Do ponto de vista químico ainda existe uma

grande coleção de componentes naturais que não foram isolados e estudados. Por

outro lado, uma grande quantidade de compostos, já isolados e com estrutura

química determinada, as suas atividades biológicas ainda não foram investigadas

(DI STASI, 1996).

A descoberta de substâncias que apresentem atividade biológica é o

principal alvo das pesquisas científicas com plantas medicinais. Daí a importância e

necessidade de estudos fitoquímicos guiados pelos bioensaios, sejam In vivo ou In

vitro (CALIXTO; YUNES, 2001).

Entre os fatores limitantes para a pesquisa merecem destaque as

variações temporais e espaciais na composição química das espécies, bem como

nas proporções relativas de metabólitos secundários que ocorrem em diferentes

níveis (sazonais e diárias; intraplanta, inter e intraespecífica). Apesar da existência

de um controle genético, a presença dos compostos pode sofrer modificações

resultantes da interação de processos bioquímicos, fisiológicos, ecológicos e

17

evolutivos. Os metabólitos secundários representam uma interface química entre as

plantas e o ambiente circundante, portanto, sua síntese é freqüentemente afetada

por condições ambientais (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; MURAKAMI et al, 2009a).

Na busca da comprovação de atividades farmacológicas, que possibilitem

não apenas o conhecimento dos compostos existentes, mas também dos princípios

ativos, os estudos químicos realizados para a espécie procuram aliar os efeitos

desejáveis a dosagens adequadas para a cura de doenças, nesta perspectiva A.

zerumbet tem sido relativamente bem estudada nos seus aspectos químicos (Tabela

1 e 2).

Os terpenos são os metabólitos secundários mais encontrados para a

espécie, principalmente monoterpenos como 1,8-cineol, terpinen-4-ol, timol, eugenol

e terpineno, compostos marjoritários em seus óleos essenciais, mas também

encontrados em folhas, flores, rizoma e sementes (DE POOTER et al. 1995;

TAWATA et al. 1996a; XU et al. 1996; YUAN-YING et al. 1997; ZOGHBI et al. 1999;

ALI et al. 2002; CAVALCANTI et al. 2004; ELZAAWELY; XUAN; ELZAAWELY;

XUAN; TAWATA, 2007a; TAWATA, 2007b; MURAKAMI et al. 2009a, 2009b;

INDRAYAN et al. 2010; VICTORIO et al. 2010; PADALIA et al. 2010; SATOU et al.

2010; BARCELOS et al. 2010; SANTOS et al. 2011;).

Flavonóides também são encontrados na espécie, seja por cromatografia

ou com isolamento de rutinas, quecertinas, catequinas, epicatequinas e kaempferois

de folhas e rizoma de A. zerumbet (MPALANTINOS et al 1998; CRUZ et al. 2009;

VICTORIO et al. 2009a). Com esta finalidade, Krishna e Chaganty, (1973) e Itokawa,

Morita e Mihashi (1981) isolaram compostos químicos presentes em A. zerumbet,

identificando alguns flavonóides como a cardamomina e a alpinetina do rizoma e

sementes da espécie.

Para a identificação de cumarinas em A. zerumbet, alguns estudos

mostram presença deste metabólito para as folhas e rizoma da espécie (CRUZ et al.

2009; SILVEIRA; BRAGA, 2010). Buscando essa identificação, Corrêa et al. (2011)

realizaram o perfil cromatográfico de extratos e frações do rizoma de A. zerumbet e

identificaram presença de cumarinana maioria dos extratos e frações avaliados.

18

TABELA 1. Constituintes químicos citados para folhas e rizoma de Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt. & R. M. Sm. no período revisado (1973-2011).

Parte da Planta

Composição Química Referência Bibliográfica

Folhas

5,6-dihidrokavaina (DK), dihidro-5,6-dihidrokavaina (DDK)

(HSU, 1987)

dihidro-5,6-dihidrokavaina (DDK) (FUJITA et al. 1994) terpinen-4ol, 1,8-cineol, sabineno, e γ-

terpineno (DE POOTER et al. 1995)

dihidro-5,6-dihidrokavaina (DDK), 4-dihidróxido-6-(2-peniletil)-2H-pirano-2-1, dimetil-[6-(2-peniletil)-2-oxo-2H-piranil-4]

fosforotinato

(TAWATA et al. 1996a)

rutina, kaempferol-3-O-rutinosideo, kaempferol-3-O-glicuronideo,

isoquercitrina, catechina e epicatechina (MPALANTINOS et al. 1998)

limoneno, terpinen-4-ol, e γ-terpineno (ZOGHBI et al. 1999)

1,8-cineol, cânfora e cinamato de metila (ELZAAWELY; XUAN; TAWATA, 2007a) taninos, alcalóides, flavonóides, xantonas

e cumarinas (CRUZ et al. 2009)

rutina e kaempferol-3-O-glicuronídeo (VICTORIO et al. 2009a) 5,6-dihidrokavaina (DK), dihidro-5,6-dehidrokavaina (DDK) e labdadieno

(CHOMPOO et al. 2011)

5,6-dihidrokavaina (DK), dihidro-5,6-dihidrokavaina (DDK) e labdadieno

(UPADHYAY et al. 2011)

Rizoma

cardamomina e alpinetina (ITOKAWA; MORITA; MIHASHI, 1981) 5,6-dihidrokavaina (DK), dihidro-5,6-

dihidrokavaina (DDK) (HSU, 1987)

β-eudesmol, nerolide, epóxido humuleno II e α-hidroxi-dihidroagarofurano

(MORITA et al. 1996)

Zerumbetol (YUAN-YING et al. 1997) Ésteres glucosidios do acido ferúlico (MASUDA et al. 2000)

dihidro-5,6-dihidrokavaina (DDK), [6-(2-feniletil)-2oxi-2H-piranil-4]

(LIAO et al. 2000)

dihidro-5,6-dihidrokavaina (DDK) e cinamato de metila

(ELZAAWELY; XUAN; TAWATA, 2007)




(UPADHYAY et al. 2011)

Flavonóides, mono, di, tri e sesquiterpenos, saponinas, cumarinas,

taninos e alcalóides (CORREA et al. 2011)

19

TABELA 2. Constituintes químicos citados para Flores, Sementes e Óleos essenciais de Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt. & R. M. Sm. para o período revisado (1973-2011).

Parte da Planta

Composição Química Referência Bibliográfica

Flores

terpinen-4-ol, 1,8-cineol, sabineno, e γ-terpineno

(DE POOTER et al. 1995)

1,8-cineol, terpinen-4-ol e sabineno (ZOGHBI et al. 1999) ácido p-hidroxibenzóico, ácido ferúlico e

ácido siringico (ELZAAWELY; XUAN;

TAWATA, 2007b) 5,6-dihidrokavaina (DK), dihidro-5,6-dihidrokavaina (DDK) e labdadieno


Sementes

cardamomina e alpinetina (KRISHNA; CHAGANTY, 1973)

Zerumin A e Zerumin B, (E)-15,16-bisnorlabda-8(17), 11-dieno-13-ona e

coronarina E (XU et al. 1996)

p-hidroxibenzóico, ácido siringico e vanilina

(ELZAAWELY; XUAN; TAWATA, 2007b)



Óleos essenciais

fenchona, cânfora, 4-isopropil-2-ciclohexeno-1-ona, 7,7-

dimetilbiciclo[4.1.1]octa-3-ona, 7,7-dimethilbiciclo[4.1.1]octa-2-ona, nezukona

e um isômero da nerukona (folhas e flores)

(MATSUBARA et al. 1994)

Isotimol, timol e eugenol (TAWATA et al. 1996b)

β-pineno, 1,8-cineol, terpinen-4-ol (folhas e rizoma)

(ALI et al. 2002)

1,8-cineol, terpinen-4-ol, γ-terpineno, p-cimeno, sabineno (folhas e ramos)

(CAVALCANTI et al. 2004)

1,8-cineol, cânfora, cinamato de metila e borneol (flores); criptona, alfa-cadinol, T-muurolol, alfa-terpineol, delta-cadineno e

terpinen-4-ol (sementes)

(ELZAAWELY; XUAN; TAWATA, 2007a)

p-cimeno, 1,8-cineol, terpinen-4-ol, α-pineno, β-pineno e limoneno, β-cariofileno

e α-cariofileno e cinamato de metila, cânfora (folhas)

(MURAKAMI et al. 2009a) (MURAKAMI et al. 2009b)

Terpinen-4-ol, 1,8-cineol e T-cardinol (INDRAYAN et al. 2010) terpinen-7-ol, sabineno hidratado, 1,8-

cineol (VICTORIO et al. 2010)

terpinen-4ol e 1,8-cineol (folhas), terpinen-4-ol, 1,8-cineol, linalol, sabineno (flores);

acetato de endo-fenchyl, 1,8-cineol, canfeno, acetato de bornil e borneol

(rizoma)

(PADALIA et al. 2010)

α-pineno, p-cimeno, 1,8-cineol e limoneno (SATOU et al. 2010) terpinen-4-ol, óxido de cariofileno, trans-

hidrato de sabineno e 1,8-cineol (óleo das folhas)

(BARCELOS et al. 2010)

terpinen-4-ol, 1,8-cineol, γ-terpineno e p-cimeno (óleo das folhas)

(SANTOS et al. 2011)

20

2.1.2 Aspectos farmacológicos

Os estudos farmacológicos de produtos naturais permitem comprovar a

eficácia das plantas de uso popular e comercializadas. Além disso, certifica os

efeitos colaterais, relacionando esses efeitos às doses e a um possível mecanismo

de ação em várias espécies de animais de experimentação (LAPA et al.1999).

Assim, devido ao aumento de pesquisas farmacológicas visando comprovar os

efeitos de plantas medicinais, o número de publicações a cerca da farmacologia

cresce favoravelmente.

A revisão de literatura para A. zerumbet, feita no período de 1973 a 2011,

mostrou que alguns aspectos farmacológicos da espécie já foram estudados (Tabela

3). Entre as publicações feitas neste período citamos os estudos que objetivaram

avaliar a atividade anti-hipertensiva da espécie, tanto para folhas quanto para óleos

essenciais das folhas e rizoma. Estes estudos sobre a ação hipotensora foram

realizados em leito vascular mesentérico, para avaliar o efeito vasodilatador da

espécie, demonstrando em seus resultados que o efeito anti-hipertensivo explica-se

da vasodilatação e redução da pressão arterial em ratos (LARANJA;

BERGAMASCHI; SCHOR, 1991, 1992; LORDELO et al. 2000; EMILIANO, 2002;

LAHLOU et al. 2002, 2003; MOURA et al. 2005; VICTORIO et al. 2009b; PINTO et

al. 2009; BARCELOS et al. 2010; SANTOS et al. 2011).

Três estudos que buscaram avaliar a atividade diurética de A. zerumbet

merecem destaque, Laranja, Bergamaschi e Schor, (1991,1992) e Lordelo et al.

(2000) que avaliaram, extratos das folhas da espécie em estudos clínicos de 1ª fase

e indicaram diminuição no volume ou da frequência urinária dos pacientes

investigados.

Alguns estudos que avaliaram a atividade espasmolítica de óleos

essenciais de A zerumbet mostraram seu efeito relaxante no íleo e nervo ciático de

ratos, inclusive mostrando que sua ação é dose-dependente quando analisada sobre

o potencial de ação composto do nervo ciático dos ratos (BEZERRA et al. 2000;

MOREIRA et al. 2001; LEAL-CARDOZO et al. 2004).

A ação sobre o sistema nervoso central também foi evidenciada no

período de revisão para a espécie, as atividades antidepressivas e ansiolíticas foram

citadas (ARAUJO et al. 2009; MURAKAMI et al. 2009b; SATOU et al. 2010, 2011).

Inclusive Araujo et al. (2005) avaliaram os efeitos analgésicos dos óleos essenciais

21

de A. zerumbet por dois modelos, evidenciando efeito positivo em todas as doses

para o modelo de indução pelo ácido acético e latência dose-dependente para o

modelo de placa quente, os autores sugeriram que o mecanismo de ação envolve a

ação dos receptores opioides.

Os efeitos antibióticos da espécie já foram citados por Lobato et al.

(1989), Yu et al. (1993), Lima et al. (1993), Sa et al. (1994), Wang e Huang, (2005),

Elzaawely, Xuan e Tawata (2007), Costa et al. (2007, 2008), Indrayan et al. (2010).

Estes estudos mostram alto espectro de microrganismos já avaliados como:

Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, P. vulgaris, Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Salmonella typhi, Streptococcus aureus, S.

mutans, S. pneumoniae, S. pyogenes, Pseudomonas aeroginosa, Neisseria

gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, B. cereus, Serratia marcencens,

Enterococcus faecalis, Mycobacterium smegmatis, Candida albicans. Os resultados

não mostram alta atividade, mas na maioria dos estudos estes resultados aparecem

para microrganismos gram-positivos.

22

TABELA 3. Efeitos farmacológicos descritos para diferentes partes de Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt. & R. M. Sm. no período revisado (1973-2011).

Parte da Planta

Efeitos Farmacológicos

Referência Bibliográfica

Folhas

Diurético (LARANJA; BERGAMASCHI; SCHOR, 1991) (LARANJA; BERGAMASCHI; SCHOR, 1992)

(LORDELO et al. 2000)

Antimicrobiano

(SA et al. 1994) (WANG; HUANG, 2005)

(VORAVUTHIKUNCHAI et al. 2005) (ELZAAWELY; XUAN; TAWATA, 2007)

(COSTA et al. 2007) (COSTA et al. 2008)

Antioxidante (ELZAAWELY; XUAN; TAWATA, 2007)

(WONG et al. 2009) Inibidor enzimático (UPADHYAY et al. 2011)

Hipotensivo

(LARANJA; BERGAMASCHI; SCHOR, 1991) (LARANJA; BERGAMASCHI; SCHOR, 1992)

(LORDELO et al. 2000) (EMILIANO, 2002)

(MOURA et al. 2005) (VICTORIO et al. 2009)

Rizoma

Antiulcerogênico (HSU, 1987)

Antioxidante (MASUDA et al. 2002)

Antimicrobiano (COSTA et al. 2007)

(COSTA et al. 2008) Inibidor enzimático (UPADHYAY et al. 2011)

Óleo Essencial

Antimicrobiano

(LOBATO et al. 1989) (YU et al. 1993)

(LIMA et al. 1993) (INDRAYAN et al 2010)

Espasmolítico (BEZERRA et al. 2000) (MOREIRA et al. 2001)

(LEAL-CARDOSO et al. 2004) Analgésico (ARAUJO et al. 2005)

Ansiolítico (MURAKAMI et al. 2009b)

(SATOU et al. 2010) (SATOU et al. 2011)

Antidepressivo (ARAUJO et al. 2009)

Hipotensivo

(LAHLOU et al. 2002) (LAHLOU et al. 2003) (PINTO et al. 2009)

(BARCELOS et al. 2010) (SANTOS et al. 2011)

23

2.1.3 Efeitos tóxicos de A. zerumbet

No período da revisão, poucos trabalhos relataram efeitos tóxicos ou

citototóxicos para A. zerumbet. Costa et al. (2007) e Corrêa e Costa (2008) testaram

a atividade citotóxica dos extratos clorofórmicos, hexânicos, hidroalcoólicos

acetônico e metanólico da espécie, sobre células HEp-2, NCI-H292, KB e HeLa,

cujos resultados mostraram ausência de citotoxicidade significativa para todos os

extratos testados.

No ano seguinte, Corrêa et al. (2009), testaram quatro frações do extrato

metanólico do rizoma de A. zerumbet e verificaram atividade citotóxica significativa

para a fração hexânica frente a NCI-H292 e Hep-2, com CI50 de 21 e 12 µg/mL,

respectivamente e para a fração diclorometano frente a linhagem celular NCI-H292,

com CI50 de 29 µg/mL.

Oliveira (2008) avaliou a atividade citotóxica e toxicidade aguda em ratos

para os óleos essenciais e extrato aquoso das folhas de A. zerumbet e não

identificou nenhuma ação citotóxica.

2.2 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE AS CUMARINAS

As cumarinas constituem uma classe de metabólitos secundários,

amplamente distribuídos no reino vegetal e excepcionalmente encontradas em

bactérias e fungos (CELEGHINI, 2001).

A palavra cumarina tem origem do caribenho cumaru, nome popular de

Dipteryx odorata (Aubl.) Willd. planta pertencente a família Fabaceae, também é

conhecido por fava-tonka que é encontrado no norte do Brasil e cujas sementes

contém grande quantidade de cumarina (1 a 3%).

A primeira cumarina natural foi isolada por Vogel em 1820 da espécie

Coumarona odorata. Hoje se sabe que os compostos cumarínicos podem estar

presentes em diferentes partes das plantas tanto nas raízes como flores e frutos e

são encontrados com grande freqüência nas Angiospermas das famílias Apiaceae,

Rutaceae e Asteraceae e com menor frequencia nas famílias de Fabaceae,

Oleaceae, Moraceae e Thymeleaceae (RIBEIRO, 2002).

A Mikania glomerata Spreng, popularmente conhecida no Brasil como

“Guaco Liso”, “Guaco de Cheiro” e “Cipó Caatinga”, é conhecida por apresentar

grandes quantidades de cumarinas que são consideradas marcadores químicos

24

nesta espécie. Outra planta com grandes teores de cumarina e utilizada

popularmente para bronquites e resfriados é a Amburana cearensis, conhecida

como “imburana-de-cheiro”, “Cerejeira” e “Cumaru” (MELLO, 2009)

Cumarinas sintéticas têm tido grande aplicabilidade comercial, sendo

utilizadas para aromatizar manteiga, tabaco, numerosos medicamentos e perfumes

(MELLO, 2009) e também como fragrância em desodorantes anti-transpirantes,

loções, cremes faciais e corporais, spray de cabelo, xampus, gel e sabonetes de

banho. Estima-se que a exposição humana diária a cumarinas seja cerca de 0,04

mg/kg/dia em cosméticos e perfumaria (LAKE, 1999).

2.2.1 Ações farmacológicas de cumarinas

Às atividades bioquímicas e terapêuticas atribuídas as cumarinas

dependem de seus padrões de substituição que podem resultar em isômeros

naturais conhecidos como cromonas (5H-1-benzopiran-5-onas) (VAZ; MOREIRA,

2009).

As cumarinas têm como representante mais simples a 1,2-benzopirona,

mas apresentam uma diversidade estrutural significativa que pode influenciar a sua

atividade biológica. Na revisão, alguns estudos destacaram-se por avaliar atividades

farmacológicas de derivados cumarinicos sintetizados ou isolados de plantas.

Na literatura, trabalhos citaram atividade antimicrobiana destes derivados

frente a Bacillus subtilis, B. dysenteriae, B. cereus, Corynebacterium diphtheriae,

Klebsiella pneumoniae, Leishmania braziliensis, Micrococcus luteus, Proteus

mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae,

Staphylococcus aureus, S. aureus meticilina-resistente e Streptococcus pyogenes,

com bons resultados chegando a 4.9 μg/mL de CMI frente a B. dysenteriae e 25 mm

frente a K. pneumoniae e P. aeruginosa em teste de difusão em agar. (REHMAN et

al. 2005; BRENZAN et al. 2008; SMYTH et al. 2009; KALKHAMBKAR et al. 2011;

SUN et al. 2011).

Destacamos três estudos que objetivaram avaliar a atividade antifúngica

de derivados cumarínicos, onde os autores analisaram cumarinas isoladas de

Baccharis darwinii, de plantas do gênero Pterocaulon, assim como derivados

sintetizados a partir de malononitrila e salicilaldeido, frente a Aspergillus flavus, A.

Níger, A. fumigatus, A. alliaceus, A. carbonarius, A. ochraceus, Candida albicans, C.

tropicalis, C. glaberata, Cryptococcus neoformans, Fusarium solani, Microsporum

25

gypseum, M. canis, Saccharomyces cerevisiae, Trichophyton rubrum, T. longifusus e

T. mentagrophytes. Os resultados mostraram que as cumarinas foram ativas frente a

todos os microrganismos (STEIN et al. 2006; COSTA et al. 2008; KURDELAS et al.

2010).

A atividade anti-inflamatória também foi citada para avaliar cumarinas

sintetizadas, assim como, moléculas isoladas de Corydalis heterocarpa e Ligusticum

lucidum. Estas cumarinas mostraram alta atividade para modelos tradicionais como

edema de orelha e pata induzido por formalina, mas também foram avaliadas em

testes frente a linhagem de carcinoma humano para identificar mecanismo de ação

anti-inflamatório. A libanoridina, furanocumarina isolada de C. heterocarpa, inibiu os

níveis de expressão de proteínas mediadoras de processos inflamatórios

(KALKHAMBKAR et al. 2008; KANG et al. 2009; MENGHINI et al. 2010;

KALKHAMBKAR et al. 2011).

A atividade antioxidante de cumarinas é estudada na literatura, conforme

mostra o trabalho de Torres et al. (2006), o qual analisou a atividade antioxidante de

oito cumarinas pelo método de captura do radical livre DPPH (1,1-difenil-2-

picrilhidrazil), obtendo resultados significativos. Rehakova et al. (2008) também

utilizaram o método do DPPH, aprimorando-o, e testaram quatro cumarinas naturais

e 18 análogos sintéticos. Os resultados obtidos mostraram a 7,8-diidroxi-4-

metilcumarina como excelente catalisador do radical DPPH. Sun et al. (2011)

sintetizaram e avaliaram a redução do DPPH por cinco derivados do composto 4-

arilcumarina indicando atividade antioxidante promissora para estas moléculas.

Estudos de atividade hepato-protetora, foram realizados por Bilgin et al.

(2011), que estudaram os efeitos protetores da cumarina e seus derivados contra a

hepatotoxicidade em ratos induzida pelo tetracloreto de carbono. Os derivados

cumarínicos, escoparone e esculetina, foram os únicos que apresentam uma

atividade hepato-protetora.

Outros estudos foram realizados e comprovam os efeitos analgésico,

antitrombótico, anticoagulante, antiespasmódico, antihipertensivo, anticonvulsivante

e inibidor de HIV para derivados cumarínicos (RENDENBACH-MÜLLER, et al. 1994;

HOSSAIN, et al. 1996; ZHAO, et al. 1997; KUSTER; ROCHA, 1999; AMIN, et al.

2008; KALKHAMBKAR et al. 2008).

26

2.2.2 Efeitos tóxicos da cumarina

Segundo o Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos a cumarina

era utilizada como fixadora de agentes flavorizantes em comida e excipientes

farmacêuticos. Em resposta a investigações conduzidas pelos fabricantes de

cumarinas, houve a demonstração que a cumarina produz toxicidade ao fígado, em

quantidades semelhantes as que aparecem na alimentação humana. Esta foi então

recategorizada, em 1954 pela United States Food and Drug Administration (FDA)

como adulterante. Desde este momento, sua adição em alimentos para o ser

humano foi proibida e a importação restringida (ARAUJO et al. 2004).

A cumarina é uma substância tóxica utilizada dérmica ou oralmente.

Quando aplicada diretamente sobre a membrana mucosa, é extremamente irritante

e após uso prolongado causa erupções. Com seu potencial efeito tóxico ao fígado –

em alguns casos levando a morte – o uso de cumarina oral em diversos países foi

restringido ou suspenso (COUMARIN, 1996).

Na Austrália a droga Lodema foi suspensa em agosto de 1996 quando o

Comitê Australiano de Avaliação de Drogas recebeu 10 relatos de pacientes que

desenvolveram anormalidades em testes de avaliação do fígado ou sinais mais

graves de hepatotoxidade (incluindo duas mortes) associado ao uso do fármaco

contendo 200 mg de cumarina. Na Suíça dois casos de hepatotoxicidade ligados a

administração de cumarina, levaram o Escritório Intercontinental de Controle de

Medicamentos (OIMC) suíço, a revisar medidas regulamentadoras do seu

risco/benefício. Mais tarde foi proibida na França pelo surgimento de três casos de

hepatotoxicidade irreversível e em seguida foi suspensa na Bélgica seguindo o

exemplo da França (COUMARIN, 1996).

No Brasil, segundo Decreto-Lei nº 50.040, de 24 de janeiro de 1961 que

dispõe sobre as normas técnicas especiais reguladoras do emprego de aditivos

químicos a alimentos, define que é proibido aos flavorizantes a adição de cumarina

por ser considerada uma substância prejudicial à saúde. Sua utilização é

considerada adulteração do produto (BRASIL, 1961).

Devido sua toxicicidade as cumarinas têm sido objeto de estudo de

pesquisadores que realizaram estudos para verificação de seus efeitos tóxicos. Lake

et al. (2002) observaram que os derivados cumarinicos eram indutores de

hepatotoxicidade, realizando um estudo comparativo entre dois modelos

27

experimentais para avaliar efeitos hepatotoxicos em ratos Sprague Dawley e em

hamsters Sirian. Os resultaram mostraram uma maior sensibilidade dos ratos a

hepatotoxicidade induzida pela cumarina do que os hamsters.

Também são citados na literatura, estudos que avaliam a atividade

citotóxica de derivados cumarínicos sintéticos e isolados de Micromelum minutum e

Corydalis heterocarpa pelo método clássico do MTT frente a linhagens celulares

(HL-60, BV-173, K-562, LAMA-84, CEM-SS, HeLa, Raji, LS180 e MCF-7) com

valores de CI50 variando entre 2,5 a 60 µg/mL (KOSTOVA et al. 2005; SUSIDARTI

et al. 2009; KANG et al. 2009; SHAFIEE et al. 2010)

Helguera et al., (2005) investigaram a atividade carcinogênica de Modelos

Topológicos Substruturais Moleculares (TOPS-MODE), para identificar drogas

carcinogênicas e não-carcinogênicas, entre elas foram selecionadas a cumarina

(1,2-benzopirona) e a 3,4-dihidrocumarina, que mostraram-se carcinogênicas.

Aptula et al. (2006) utilizaram um método in vitro para avaliar o potencial

de sensibilização cutânea de compostos com mecanismos de reação eletrofílicos e

proeletrofílicos, onde cumarina (1,2-benzopirona) e dihidrocumarina apresentaram

pouca sensibilidade e moderada, respectivamente.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 SÍNTESE DE DERIVADOS CUMARÍNICOS

Foi utilizado neste estudo a 1,2-benzopirona (1) da Sigma-Aldrich (Figura

2) como padrão comercial e cumarinas sintetizadas no Laboratório de Materiais

Poliméricos e Caracterização do Departamento de Engenharia Química da

Universidade Federal de Pernambuco. A metodologia direta para a obtenção do

produto de partida selecionado para o desenvolvimento desse trabalho seguiu Costa

et al. (2008), tendo como reagentes de partida as substâncias 2-hidróxi-salicilaldeído

substituído (2) e a malononitrila (3), os quais reagem em condições brandas para dar

a 3-cianocumarina (4). Para a cumarina ácida (5) foi adicionado 0,80g de

malononitrila (12,5mmol) a 1,1mL de salicilaldeído (10mmol) em 50 mL de solução

de NaHCO3 0,05M e agitados a temperatura ambiente. Após 16h foi adicionado à

28

suspensão amarelada 2 mL de HClconc., a mistura reacional ficou em refluxo e sob

agitação a 90°C durante 2.5 h, sendo adicionado posteriormente 20 mL da solução

de NaHCO3 1M. A reação ficou em refluxo por 2h a 90°C. A mistura foi acidificada

com 2 mL de HClconc. ajustando o pH para ≤ 2. O material foi filtrado com auxilio de

funil de Büchner e lavado com água gelada.

FIGURA 2 – Esquema reacional das etapas de reação para Cianocumarina e Cumarina Ácida

3.2 COLETA VEGETAL E PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS

O rizoma fresco de A. zerumbet foi coletado em julho-2011 de uma horta

com cultivo padronizado do Laboratório de Fitoterapia do Instituto de Pesquisas

Agropecuárias de Pernambuco (IPA). O material foi seco a temperatura ambiente

por 15 dias e triturado em forrageira para posterior extração.

O material seco e triturado coletado em ambos os períodos foram postos

em maceração a exaustão com três trocas de solventes a cada sete dias para

produção de extratos brutos metanólico e acetônico utilizando 35g de planta seca

para 300 mL de solvente (ZELNIK et al. 1977). A partir do extrato metanólico

realizou-se extração líquido-líquido para fracionamento com solventes de

polaridades crescentes: hexano, diclorometano e butanol, a fim de extrair compostos

pela afinidade de polaridade com cada composto orgânico.

Legenda: 1 – 1,2-benzopirona (Sigma-Aldrich); 2 - Salicilaldeido; 3 – Malononitrila; 4 – Cianocumarina; 5 – Cumarina Ácida.

29

Adicionalmente, foram realizadas extrações por maceração, decocção,

turbólise e soxhlet com acetato de etila, etanol e metanol (Tabela 4).

Todos os extratos e frações obtidos foram evaporados à secura em

evaporador rotativo. Posteriormente, os extratos e frações foram armazenados em

geladeira, protegidos da luz, para realização do doseamento de cumarinas, triagem

fitoquímica e atividade citotóxica.

TABELA 4 – Metodologia de extração do rizoma de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. por maceração, decocção, turbólise e soxhlet.

Método de extração

Massa vegetal / Volume do solvente

Solventes Condições

Maceração 20 g / 500 mL Metanol Sete dias

Recipiente fechado Protegido da luz

Etanol Acetato de Etila

Decocção 20 g / 200 mL Metanol Trinta minutos

Chapa de aquecimento Temperatura de ebulição


Turbólise ou turbo extração

20 g / 400 mL Metanol Três tempos de 5 min

Triturador industrial Temperatura ambiente


Soxhlet 15 g / 300 mL Metanol Seis horas

Extrator de Soxhlet Temperatura de ebulição


3.3 ESTUDO FITOQUÍMICO DO EXTRATO

Para comprovar a presença de cumarinas nos extratos do rizoma de A.

zerumbet foram utilizados dois métodos: Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

utilizando eluente tolueno: eter (1:1 saturado com ácido acético 10%) e KOH

etanólico 10% para revelar a placa (MARKHAM, 1982; WAGNER, 1984) e o método

de quantificação espectrofotométrica (OSÓRIO; MARTINS, 2004).

Para a CCD as placas foram lidas em câmara escura com e sem

revelador. Sem revelador o método identifica presença de cumarinas com manchas

escuras quando visualizado em lâmpada ultravioleta com comprimento de onda de

254 nm e manchas azuis e verdes com comprimento de onda de 365 nm. Com

revelador, as manchas azuis ou azuis esverdeado mostraram presença de

30

cumarinas simples na amostra. Para interpretação dos resultados, foi atribuído

símbolos pela intensidade da mancha de identificação de cumarinas na amostra,

onde (+) corresponde a pouca, (++) moderada e (+++) alta concentração. Foi

utilizado como padrão a esculetina, 1,2-benzopirona e a cumarina ácida sintetizada

(Tabela 5).

TABELA 5 – Reagentes utilizados no método de identificação de cumarinas por cromatografia em camada delgada utilizando esculetina, 1,2-benzopirona e cumarina ácida como padrões (MARKHAM, 1982; WAGNER, 1984).

Metabólito Sistema Eluente

Padrões Revelador Detecção (λλλλ)

Cumarinas

Tolueno: éter (1:1 saturado

com ácido acético 10%)

Esculetina 1,2-benzopirona cumarina ácida

Sem Revelador

UV-254 nm: manchas escuras UV-365 nm: Azul, verde, amarelo e violeta-azulada

KOH etanólico 10%

UV-365 nm: azul e azul-esverdeado (cumarina simples); amarelo, azul e marrom (derivados)

No método de doseamento espectrofotométrico, os extratos secos foram

ressolubilizados em metanol 80% na concentração de 0,5 mg/mL. Alíquotas de 1 mL

dos extratos foram transferidas para tubos de ensaios e acrescentou-se 2 mL de

água destilada, 0,5 mL de solução de acetato de chumbo 5% e o volume completado

para 10 mL com água destilada. Transferiu-se 2 mL da solução para outro tubo de

ensaio e completado o volume de 10 mL com solução de HCl 0,1M. Após 30 minutos

em temperatura ambiente e ao abrigo da luz, as medidas das absorbâncias foram

realizadas em espectrofotômetro a 320 nm. A curva de calibração foi construída com

1,2-benzopirona (Sigma-Aldrich), sendo retiradas cinco alíquotas, obtendo-se as

concentrações finais de 0,4-12 µg/mL. Foi utilizado HCl 0,1M para zerar o

equipamento. Os resultados foram expressos como mg equivalente de 1,2-

benzopirona / g de extrato seco e porcentagem de cumarina no extrato seco.

3.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

Os ensaios foram realizados frente a nove microrganismos pertencentes à

coleção de microrganismos do Departamento de Antibióticos da Universidade

Federal de Pernambuco. Representantes dos grupos de bactérias Gram-positivas:

Staphylococcus aureus (DAUFPE 01); Bacillus subtilis (DAUFPE 16); Enterococcus

faecalis (DAUFPE 138); Micrococcus luteus (DAUFPE 06); bactérias Gram-

31

negativas: Escherichia coli (DAUFPE 224); Pseudomonas aeruginosa (DAUFPE 39);

Serratia marcescens (DAUFPE 398); Bacilo álcool-ácido resistente: Mycobacterium

smegmatis (DAUFPE 71); e levedura Candida albicans (DAUFPE 1007).

3.4.1Teste de difusão em ágar (disco)

A atividade antimicrobiana foi verificada “in vitro”, pelo método de difusão

em disco de papel (BAUER et al, 1966). A concentração do extrato foi de 200.000

µg/ml em dimetilsufóxido (DMSO) e os discos de papel de 6 mm de diâmetro foram

embebidos com 10 µl da solução correspondente a 2.000 µg do extrato bruto ou

frações por disco.

As suspensões foram padronizadas segundo a escala de McFarland no

grau de turvação de 0,5 (BARRY, 1986; KONEMAN, 1997), o que correspondente a

uma concentração de aproximadamente 107-8 UFC/mL.

Resultados com halos menores que 9 mm foram indicativos de

inatividade, 9-12 mm parcialmente ativo, 13-18 mm ativo, maiores que 18 foram

considerados muito ativos (ALVES et al. 2000).

O antibiótico kanamicina (bactérias) e o antifúngico cetoconazol

(levedura) foram utilizados nos testes como fármacos padrões, nas concentrações

de 30 µg/disco e 300 µg/disco, respectivamente.

3.5 ATIVIDADE CITOTÓXICA

Para avaliação da citotoxicidade, foram utilizadas linhagens celulares

HEp-2 (derivada do tumor da laringe humana), NCI-H 292 (carcinoma

mucoepidermóide de pulmão) e HT-29 (carcinoma de cólon humano), obtida a partir

de banco de células do Rio de Janeiro, Brasil. As células foram mantidas em DMEM

- Meio Essencial Mínimo de Eagle modificado Dulbecco (Sigma), todas as linhas

celulares foram suplementados com 10% de soro fetal bovino (GIBCO), 1% solução

de antibiótico (penicilina 1000 UI/mL + estreptomicina a 250 µg/mL) e 1% de L-

glutamina 200 mM.

Para determinar a viabilidade celular, foi utilizado o corante vital Azul

Tripan (Merck) 0,4% p/v, em PBS, o qual penetra facilmente nas células danificadas

corando-as em azul, enquanto as células íntegras permanecem incolores, permitindo

assim, determinar-se a porcentagem de células vivas e células mortas

(WEISENTHAL, 1983).

32

A contagem das células foi realizada em microscópio invertido LEITZ, com

a utilização de um hemocitômetro, preenchido com uma alíquota da suspensão de

células homogeinizada.

Os testes de citotoxicidade foram realizados utilizando o ensaio de

redução do 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) (Sigma Aldrich

Co., St. Louis, MO/EUA). Para todas as experiências, as células tumorais foram

plaqueadas em placas de 96 poços (105 células/mL). Os compostos foram testados

na concentração de 50 µg/mL e dissolvidos em Dimetilsulfóxido (DMSO) a 1%,

incubou-se durante 72 h. Os grupos controle receberam a mesma quantidade de

DMSO. Após 69 h de tratamento, 25 µL de MTT (5 mg/mL) foi adicionado, três horas

mais tarde, os cristais de formazan foram dissolvido em 100 µL de DMSO e a

absorvância foi medida a 595 nm em placa espectrofotómetro. A densidade óptica

(DO) média dos poços foi comparada com a DO média dos poços controles

(MOSMANN, 1983; ALLEY, 1988)

Uma escala de intensidade foi utilizada para avaliar o potencial citotóxico

das amostras testadas. Amostras sem atividade (1 a 20% de inibição), com pouca

atividade (inibição de crescimento celular variando de 20 a 50%), com atividade

moderada (inibição de crescimento celular variando de 50 a 70%) e muito ativo

(inibição de crescimento variando de 70 a 100%)

33

4 RESULTADOS

Seguem abaixo todos os resultados deste estudo em forma de artigo

científico, onde o primeiro foi submetido e encontra-se nas normas da Revista

Química Nova e o segundo ainda está sendo analisado para qual periódico da área

será submetido.

5.1 ARTIGO 1

TÍTULO: Comparação da atividade antimicrobiana de extratos brutos e frações de Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt & R. M. Sm com cumarinas sintéticas.

ABSTRACT

Crude extracts and fractions of rhizome of Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt & Smith

were produced and performed for determining the levels of coumarin by

spectrophotometry to relate the antimicrobial activity against nine microorganisms

with the levels for the species. The extracts and fractions that had the highest content

of coumarins also showed moderate activity against Gram-positive and acid-fast

bacilli, coumarins used as standards were also active against the same

microorganisms. Only dichloromethane and hexane fraction showed pronounced

antifungal activity against Candida albicans. This was the first study a coumarin

assay for the species.

KEYWORDS: Alpinia zerumbet; antimicrobial activity; coumarins.

34

INTRODUÇÃO

Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt & R. M. é originária da Ásia e conhecida

popularmente no Nordeste brasileiro por colônia, Sm., está entre as plantas mais

comercializadas em mercados públicos do Recife, sendo uma das espécies mais

citadas para fins terapêuticos.1 Além de ser uma planta ornamental é muito utilizada

na medicina popular devido as suas propriedades medicinais. Com a procura da

população e interesse científico na espécie, em 2009 o Mistério da Saúde, através

do Sistema Único de Saúde (SUS) a incluiu na Relação Nacional de Plantas

Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS).2

Dentre as propriedades farmacológicas comprovadas para a espécie, destacam-se

os efeitos hipotensor,3-8 diurético,9-11 sobre o sistema nervoso central com efeitos

antidepressivo, analgésico e ansiolítico,12-15 antioxidante16,17 e antimicrobiano.18-23

Do ponto de vista químico, A. zerumbet tem sido relativamente bem estudada com

predominância na identificação de terpenos e flavonóides, sendo o 1,8-cineol e

terpinen-4-ol os monoterpenos mais citados.8,23-27

Este trabalho teve como objetivo identificar e quantificar cumarinas no rizoma de A.

zerumbet por métodos cromatográficos e espectrofotométricos, assim como, avaliar

a atividade antimicrobiana de extratos brutos e frações da espécie, obtidos por

diferentes métodos de extração, comparando os resultados dos extratos e frações

com cumarinas sintéticas.

35

PARTE EXPERIMENTAL

Derivados cumarínicos

Foi utilizado neste estudo comparativo a 1,2-benzopirona (1) da Sigma-Aldrich

(Figura 1) como padrão comercial e duas cumarinas sintetizadas no Laboratório de

Materiais Poliméricos e Caracterização do Departamento de Engenharia Química da

Universidade Federal de Pernambuco. Foi seguida uma metodologia direta para a

obtenção do produto de partida selecionado para o desenvolvimento desse trabalho,

tendo como reagentes de partida as substâncias 2-hidróxi-salicilaldeído substituído

(2) e a malononitrila (3), os quais reagem em condições brandas para dar a 3-

cianocumarina (4). Para a cumarina ácida (5) foi adicionado 0,80g de malononitrila

(12,5mmol) a 1,1mL de salicilaldeído (10mmol) em 50mL de solução de NaHCO3

0,05M e agitados a temperatura ambiente. Após 16h foi adicionado à suspensão

amarelada 2mL de HClconc. e a mistura reacional ficou em refluxo e sob agitação a

90°C durante 2.5h, sendo adicionado posteriormente 20mL da solução de NaHCO3

1M. A reação ficou em refluxo por 2h a 90°C. Foi realizada uma acidificação na

mistura colocando 2mL de HClconc. ajustando o pH para ≤ 2. O material foi filtrado

com auxilio de funil de Büchner e lavado com água gelada28.

Coleta vegetal

O rizoma fresco de A. zerumbet foi coletado julho-2011 de uma horta com cultivo

padronizado do Laboratório de Fitoterapia do Instituto de Pesquisas Agropecuárias

de Pernambuco (IPA). O material foi seco a temperatura ambiente por 15 dias e

triturado em forrageira para posterior extração.

36

Preparação dos extratos

Extração com solventes orgânicos

Trinta e cinco gramas do material vegetal seco e triturado foram submetidos a

maceração exaustiva com 300mL do líquido extrator, o qual foi renovado por três

vezes, a cada sete dias, para produção de extratos brutos metanólico.29 A partir do

extrato metanólico realizou-se extração líquido-líquido para fracionamento com

solventes de polaridades crescentes: hexano, diclorometano e butanol, a fim de

extrair compostos pela afinidade de polaridade com cada composto orgânico.

Adicionalmente, foram realizadas extrações por maceração, decocção, turbólise e

soxhlet com acetato de etila, etanol e metanol como solventes extratores. Na

maceração, foi utilizado 20g de material seco e triturado para cada 500 mL do

solvente extrator, por sete dias em recipiente fechado, protegido da luz. Na

decocção, utilizou-se 20g de material seco para cada 200 mL do solvente extrator,

foi colocado por trinta minutos em chapa de aquecimento, até atingir temperatura de

ebolição. Na turbólise ou turbo extração, o peso do material seco foi de 20g para

cada 400 mL do solvente extrator, foram realizados três agitações de 5min em

triturador industrial em temperatura ambiente. Finalmente, na extração por soxhlet,

foram utilizados 15g de material seco para cada 300mL de solvente extrator, onde

permaneceu por seis horas em temperatura de ebulição no extrator de soxhlet.

Todos os extratos e frações obtidos foram evaporados à secura em evaporador

rotativo. Posteriormente, os extratos e frações foram armazenados em geladeira,

protegidos da luz, para realização do doseamento de cumarinas, triagem fitoquímica

e atividade antimicrobiana.

Todos os extratos e frações obtidos foram evaporados à secura em evaporador

rotativo, menos os extratos brutos aquosos que foram congelados a -35ºC em

37

freezer e liofilizados. Posteriormente, os extratos e frações foram armazenados em


fitoquímica e atividade antimicrobiana.

Estudo fitoquímico do extrato

Para comprovar a presença de cumarinas nos extratos do rizoma de A. zerumbet

foram utilizados dois métodos: Cromatografia em Camada Delgada (CCD) utilizando

o sistema eluente tolueno: eter (1:1 saturado com ácido acético 10%) e como

revelador da placa KOH etanólico 10%30,31 e o método de quantificação

espectrofotométrica32.

Para a CCD as placas foram lidas em câmara escura com e sem revelador. Sem

revelador e com lâmpada ultravioleta no comprimento de onda de 254 nm, o método

identifica presença de cumarinas com manchas escuras, já no comprimento de onda

de 365 nm as manchas azul, verde, amarelo e violeta azulada é que identificam o

metabólito. Com revelador, as manchas azuis ou azuis esverdeado mostraram

presença de cumarinas simples na amostra, e as manchas amarelo, azul e marrom

detectaram presença de derivados cumarínicos. Para interpretação dos resultados,

foi atribuído símbolos pela intensidade da mancha de identificação de cumarinas na

amostra, onde (+) corresponde a pouca, (++) moderada e (+++) alta concentração.

O padrão utilizado foi a esculetina, 1,2-benzopirona e a cumarina ácida sintetizada.






38








Atividade antimicrobiana

Linhagens microbianas

Os ensaios foram realizados frente a nove microrganismos pertencentes à coleção

de microrganismos do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de

Pernambuco. Representantes dos grupos de bactérias Gram-positivas:

Staphylococcus aureus (DAUFPE 01); Bacillus subtilis (DAUFPE 16); Enterococcus

faecalis (DAUFPE 138); Micrococcus luteus (DAUFPE 06); bactérias Gram-

negativas: Escherichia coli (DAUFPE 224); Pseudomonas aeruginosa (DAUFPE 39);

Serratia marcescens (DAUFPE 398); Bacilo álcool-ácido resistente: Mycobacterium

smegmatis (DAUFPE 71); e levedura Candida albicans (DAUFPE 1007).

Teste de difusão em ágar (disco)

A atividade antimicrobiana foi verificada “in vitro”, pelo método de difusão em disco

de papel33. A concentração do extrato foi de 200.000 µg/mL em dimetilsufóxido

(DMSO) e os discos de papel de 6 mm de diâmetro foram embebidos com 10 µL da

solução correspondente a 2.000 µg do extrato bruto ou frações por disco.

39

As suspensões foram padronizadas segundo a escala de McFarland no grau de

turvação de 0,5,34,35 o que correspondente a uma concentração de

aproximadamente 107-8 UFC/mL.

Resultados com halos menores que 9 mm foram indicativos de inatividade, 9-12 mm

parcialmente ativo, 13-18 mm ativo, maiores que 18 foram considerados muito

ativos.36

O antibiótico kanamicina e o antifúngico cetoconazol foram utilizados nos testes

como fármacos padrões, nas concentrações de 30 µg/disco e 300 µg/disco,

respectivamente. Assim como as cumarinas 1,2-benzopirona, cianocumarina e

cumarina ácida também foram utilizadas como padrões para análise comparativa da

atividade.

RESULTADOS E DISCUSSÕES


Com base nos resultados obtidos pela CCD para identificação de presença ou

ausência de cumarinas nos extratos brutos e frações obtidas do rizoma de A.

zerumbet (Figura 2), foi realizado o doseamento de cumarinas para a espécie. Os

mesmos demonstraram um alto teor de cumarina para o extrato acetônico assim

como para o acetato de etila, independente do método de extração utilizado, seguido

pelo extrato etanólico. A maceração, junto com a turbólise foram os métodos de

extração que obtiveram os maiores teores de cumarinas em A. zerumbet,

independente do solvente (Tabela 1).

Os dados referentes à curva de calibração da solução padrão de cumarina

encontram-se à Figura 3 e Tabela 2. Com um coeficiente de linearidade da curva de

40

calibração em 0,9904 indica que o método é linear quando aplicado à substância

pura.37

Estudos com extratos brutos e frações de folhas e rizoma A. zerumbet também

identificaram por Cromatografia em Camada Delgada presença de cumarinas na

espécie38,39.

Comparando este ultimo estudo com o presente trabalho, verifica-se que os

períodos de coleta foram diferentes, setembro-200839 e julho-2011, respectivamente

e analisando com base nos dados climatológicos obtidos do Instituto Nacional de

Meteorologia – INMET, visualizamos que fatores como temperatura, umidade

relativa do ar, insolação e pluviosidade se mostraram bem distintos e podem explicar

a variação da presença de cumarinas nas frações hexânica e butanólica.40,41

Os dados climatológicos deste estudo anterior39 mostraram que a temperatura no dia

da coleta estava em máxima de 30ºC e mínima de 21ºC, a temperatura diária média

no mês de setembro foi de 24-27ºC. Valor de 82% de umidade relativa do ar para o

dia da coleta. A insolação na época da coleta foi de 8,8h com uma média no mês de

40min a 10h. A pluviosidade na coleta foi de 0 mm em 24h e quando analisamos a

pluviosidade média no mês, encontramos 50 mm em 15 dias de chuvas.

Neste estudo observou-se com os dados do INMET que a temperatura no dia da

coleta estava em máxima de 25ºC e mínima de 20,5ºC, a temperatura diária média

no mês de julho foi de 23-26ºC. Umidade relativa do ar estava em 91%. A insolação

foi de 2,5h com uma média no mês de 30min a 8h. A pluviosidade foi de 2 mm em

24h e quando analisamos a pluviosidade média no mês, encontramos 550 mm em

29 dias de chuvas.

Já é sabido que a síntese de metabólitos é frequentemente afetada pelas condições

ambientais. Chuvas constantes podem resultar em perda de substâncias que

tenham afinidade com água pela lixiviação nas folhas e raízes42, 43. A radiação solar

41

e a intensidade luminosa também interferem na concentração e composição de

metabólitos hidrossolúveis, por exemplo, óleos voláteis.44,45

Uma possível explicação para essa diferença encontrada nas frações hexânica e

butanólica pode está na volatilidade e baixa solubilidade em água que as cumarinas

apresentam46-48. Talvez seja devido a esses fatores que encontramos aumento de

cumarinas na fração hexânica comparando com outros estudos39 juntamente com a

alta pluviosidade e baixas temperaturas registradas em nossa coleta que podem ter

lixiviado os compostos hidrossolúveis e concentrado as cumarinas na fração mais

apolar.

Alguns estudos corroboram com hipótese proposta, pois eles avaliaram o processo

de variação de compostos fenólicos em Artemisia tridentata, fizeram coletas ao

longo do ano e identificaram alteração no teor de cumarinas das espécies coletadas

no verão e inverno, onde no inverno a quantidade aumentava substancialmente49.

Verificamos neste trabalho que os solventes como hexano, acetato de etila, etanol e

acetona foram os que melhor extraíram cumarinas. Outros estudos também sugerem

não apenas estes líquidos extratores, mas outros como diclorometano, butanol e

clorofórmio para extração de cumarinas, identificando a polaridade ótima do solvente

entre baixa e moderada.46,50-53

Atividade antimicrobiana

Os resultados da atividade antimicrobiana dos extratos e frações obtidos de A.

zerumbet, mostraram alta atividade antifúngica da fração hexânica e diclorometano e

atividade moderada frente a microrganismos gram-positivos e álcool-ácido

resistente, inclusive os extratos que apresentaram maiores atividades foram os que

42

tiveram altos teores de cumarinas. Estes mesmos microrganismos também foram

levemente sensíveis as cumarinas testadas (Tabela 3 e 4).

Analisando os achados das cumarinas sintéticas, a 1,2-benzopirona demonstrou

inibição do crescimento para S. aureus e M. smegmatis com halos de 21,0 ± 0,0 e

12,0 ± 0,6mm, respectivamente. No entanto, a cumarina ácida mostrou-se ativa

frente a E. faecalis, S. aureus, B. subtilis e M. smegmatis com halos de 14,0 ± 0,0,

16,0 ± 0,0, 12,0 ± 0,0 e 15,0 ± 1,2 mm, respectivamente. Apenas a cianocumarina

não apresentou atividade frente a nenhum dos microrganismos testados.

Estudos antifúngicos com cianocumarina também não identificaram ação fungicida

para a substância28, também não identificaram atividade antifúngica significativa

para derivados cumarínicos isolados de Asteraceas54.

Mas encontra-se na literatura estudos que identificaram atividade antimicrobiana de

derivados cumarínicos frente a E. coli que em nossos estudos não se mostrou

sensível a nenhuma das cumarinas testadas55,56. E um estudo que avaliou a

atividade antimicrobiana de 43 derivados cumarínicos, encontraram ação frente a

microrganismos gram-positivos, corroborando com o presente trabalho57.

A maceração com acetato de etila obteve o terceiro maior doseamento de cumarina

com teor de 39% para extrato seco e foi ativo frente a E. faecalis, S. aureus, B.

subtilis e M. luteus com halos de 13,0 ± 0,0, 14,0 ± 1,2, 15,0 ± 1,2 e 13,0 ± 0,6 mm

para halos de 13, 28, 29 e 34 mm da Kanamicina, respectivamente. O extrato

etanólico com 37,1% de cumarinas também mostrou atividade frente a E. faecalis, S.

aureus, B. subtilis e M. luteus com halos de 11,0 ± 1,2, 14,0 ± 1,2, 15,0 ± 0,6 e 13,0

± 1,2 mm para halos de 13, 28, 29 e 34 mm da Kanamicina, respectivamente.

Outros resultados merecem destaque, pela quantidade de cumarinas presente nos

extratos. O teor de cumarina presente nos extratos com acetato de etila obtido por

decocção foi de 40,8%, por soxhlet foi de 34,9% e o extrato etanólico obtido por

43

turbólise foi de 30,3%. Frente a E. faecalis esses extratos obtiveram halos de 12,0 ±

0,0, 12,0 ± 1,2 e 13,0 ± 1,2 mm para halo de 13 mm da Kanamicina,

respectivamente, assim como a atividade do extrato com acetato de etila obtido por

decocção frente a B. subtilis com halo de 17,0 ± 1,2 mm para halo de 29 mm da

Kanamicina.

O extrato bruto acetônico, que obteve o maior teor de cumarina dos extratos e

frações avaliados com 59%, apresentou atividade moderada frente a S. aureus, B.

subtilis, E. faecalis e M. luteus com halos de 11,0 ± 0,6, 13,0 ± 0,6, 12,0 ± 0,6 e 12,0

± 0,0 mm para halos de 28, 29, 13 e 34mm da Kanamicina, respectivamente.

Essa ação antimicrobiana para os extratos brutos de A. zerumbet, corrobora com

outros estudos, que atribuem ação antibiótica moderada para a espécie. 19-23 Assim

como os autores relatam que A. zerumbet possui atividade antimicrobiana

moderada, as cumarinas também costumam apresentar atividade moderada em

ensaios antimicrobianos58.

Alta ação antibiótica do extrato bruto acetônico da espécie frente a S. aureus, B.

subtilis, E. faecalis e M. luteus com halos variando de 20 a 26 mm em espécies

coletadas em setembro-2007 tambem é encontrado na literatura59, quando analisado

os dados no INMET, encontramos período com muita insolação e poucas chuvas60.

Uma possível explicação para a diferença dos resultados obtidos encontra-se na

polaridade do solvente extrator e na afinidade com os princípios ativos. É sugestivo

afirmar que a ação antibacteriana de A. zerumbet frente a microrganismos gram-

positivos encontra-se em compostos mais polares, que possuem afinidade com a

acetona. No nosso estudo, com período chuvoso e por meio da lixiviação, os

compostos mais polares podem ter diminuído sua concentração, dificultando a

extração com a acetona. No estudo59, a coleta foi realizada em estiagem,

44

proporcionou a planta equilibrar as concentrações de seus compostos polares e

apolares, fazendo com que a extração com este solvente fosse possível.

Os resultados encontrados para as frações diclorometano e hexânica apresentaram

alta atividade frente a C. albicans com halos de 42,0 ± 0,6 e 72,0 ± 0,6 mm, para

halo de 24 mm do Cetoconazol, este extrato hexânico, por exemplo, apresentou

inibição total da placa (Figura 4).

Outro estudo, também avaliou atividade antimicrobiana de extratos e frações de A.

zerumbet frente a C. albicans e a fração hexânica e diclorometano da espécie não

apresentou atividade frente a esta levedura, mas quando avaliado os dados

climatológicos no período de coleta, a mesma foi efetuada em período quente e sem

chuvas. 41,61

Uma provável explicação para a atividade antifúngica pode está na presença de

princípios ativos com baixa polaridade, pois no período chuvoso, devido a

hidrossolubilidade de compostos polares que sofrem lixiviação, deixaram os

princípios ativos apolares mais concentrados na planta, facilitando sua extração nas

frações hexânica e diclorometano.

O aumento de cumarinas na fração hexânica e esta atividade antifúngica encontrada

em nossos estudos podem possuir alguma relação, comparado com os testes

realizados por outros autores39. Provavelmente a alta pluviosidade encontrada para

o período de coleta em nosso trabalho, tenha concentrado as cumarinas mais

apolares no rizoma, tendo em vista que as mesmas possuem polaridade de baixa a

moderada e são pouco solúveis em água, que só extrai 20% deste metabólito nas

plantas.46,48

Não foram encontrados trabalhos com A. zerumbet que pudessem fortalecer a

discussão sobre a variação sazonal, porém há estudos que corroboram com nossa

explicação, quando informam que a disponibilidade hídrica é um fator importante na

45

síntese e perda de metabólitos secundários nas plantas43. Ainda discutindo essa

diferença hídrica62, óleos voláteis de Plectranthus amboinicus que nos meses de

maior precipitação a espécie apresentou níveis mais baixos de óleos essenciais,

diferentemente dos períodos de estiagem que foi a época em que eles encontram

maiores concentrações destes metabólitos.

CONCLUSÃO

Com o estudo, identificamos presença e alto teor de cumarina nos extratos brutos e

frações de A. zerumbet, conseguindo assim, identificar uma grande correlação entre

a atividade antimicrobiana frente a microrganismos gram-positivos, álcool ácido-

resistente e levedura dos extratos brutos e frações com os teores de cumarinas

neles contidos. Provavelmente, a temperatura e pluviosidade tenham concentrado

as cumarinas ativas na fração hexânica contribuindo com sua pronunciada atividade.

Novos estudos de variação sazonal de cumarinas na espécie, assim como,

isolamento de cumarinas precisam ser feitos para confirmar a relação da atividade

antibiótica da espécie com este metabólito.

46

REFERENCIAS

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49

MATERIAL SUPLEMENTAR


FIGURA 2 – Placa cromatográfica para identificação de presença de cumarina nos extratos e frações obtidos de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm.


Legenda: 1, 2 e 3 – Maceração metanólico, etanólico e acetato de etila; 4, 5 e 6 – Decocção metanólico, etanólico e acetato de etila; 7, 8 e 9 – Túrbólise metanólico, etanólico e acetato de etila; 10, 11 e 12 – Soxhlet metanólico, etanólico e acetato de etila; 13, 14 e 15 – Fração hexânica, diclorometano e butanólica; 16 – Extrato bruto acetônico; P – 1,2-benzopirona

51

TABELA 1 – Presença e teores de cumarinas por Cromatografia em Camada Delgada e doseamento por espectrofotometria nos extratos e frações secos obtidos do rizoma de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm.

Processo extrativo Solvente CCD Teor (%) ± DP CV%

Maceração

Acetato de Etila +++ 39,03 ± 3,720 9,53

Etanol Absoluto +++ 37,10 ± 6,736 18,16

Metanol P.A. + 11,29 ± 3,077 27,26

Fracionamento

(Extração Líquido-Líquido)

Hexano ++ 18,82 ± 0,930 4,94

Diclorometano + 5,70 ± 1,449 25,42

Butanol - 3,68 ± 0,526 14,29

Decocção

Acetato de Etila +++ 40,81 ± 3,878 9,50

Etanol Absoluto + 7,10 ± 1,613 22,73

Metanol P.A. + 4,95 ± 1,490 30,12

Turbólise

Acetato de Etila +++ 34,09 ± 0,672 1,97

Etanol Absoluto ++ 30,32 ± 2,812 9,27

Metanol P.A. + 13,98 ± 4,033 28,85

Soxhlet

Acetato de Etila +++ 34,95 ± 1,490 4,26

Etanol Absoluto - N/D N/D

Metanol P.A. + 1,77 ± 0,684 38,57

TABELA 2 – Alíquotas utilizadas para formar a curva de calibração com solução padrão de cumarina

Número de Aliquotas

Concentração do padrão de cumarina em µg/mL

Leitura de Absorbância em 320 nm

1 0,4 0,043

2 1,0 0,082

3 4,0 0,135

4 8,0 0,280

5 12,0 0,416

Legenda: (+, ++, +++) – Intensidade da mancha de cumarina na placa cromatográfica; (-) – ausência de cumarina nas amostras DP – Desvio-Padrão; CV – Coeficiente de Variação; N/D – Não detectado.

52

Legenda: EBAE, EBE e EBM – extrato bruto acetato de etila, extrato bruto etanólico e extrato bruto metanólico; FHe, FD e FB – Fração hexânica, Fração diclorometano e Fração butanólica; CU1 – 1,2-benzopirona (Sigma-Aldrich), CU2 – Cianocumarina, CU3 – Cumarina Ácida; [...] – Quantidade de cumarina (%) nos extratos e frações; [N/D] – Não detectado; (-) – Sem atividade; DV – Desvio Padrão.

TABELA 3 – Comparação da atividade antimicrobiana de extratos brutos e frações de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt. & R.M. Sm. obtidos por maceração com cumarinas sintéticas.

MICRORGANISMOS

EXTRATOS BRUTOS E FRAÇÕES OBTIDOS POR MACERAÇÃO

(2.000μg/disco) (halos em mm ± DV)

PADRÕES (halos em mm ± DV)

EBAE

[39,0]

EBE

[37,1]

EBM

[11,3]

FHe

[18,8]

FD

[5,7]

FB

[3,7]

CU1 CU2 CU3 Kanamicina

(30μg/disco)

Cetoconazol

(300μg/disco) (300μg/disco)

S. aureus 14,0±1,2 14,0±1,2 12,0±0,6 - - - 21,0±0,0 - 16,0±0,0 28,0±0,0 -

B. subtilis 15,0±1,2 15,0±0,6 - 15,0±0,0 14,0±0,6 - - - 12,0±0,0 29,0±0,0 -

E. faecalis 13,0±0,0 11,0±1,2 - 12,0±1,2 13,0±1,2 - - - 14,0±0,0 13,0±0,0 -

M. luteus 13,0±0,6 13,0±1,2 12,0±0,6 - 13,0±0,6 - - - - 34,0±0,0 -

E. coli - - - - - - - - - 15,0±0,0 -

P. aeruginosa - - - - - - - - - 20,0±0,0 -

S. marcescens - - - - - - - - - 15,0±0,0 -

M. smegmatis 14,0±0,0 12,0±1,2 - 16,0±0,0 19,0±1,2 15,0±0,6 12,0±0,6 - 15,0±1,2 40,0±0,0 -

C. albicans - - - 72,0±0,6 42,0±0,6 15,0±0,0 - - - - 24,0±0,0

53

Legenda: EBAE, EBE e EBM – extrato bruto acetato de etila, extrato bruto etanólico e extrato bruto metanólico; CU1 – 1,2-benzopirona (Sigma-Aldrich), CU2 – Cianocumarina, CU3 – Cumarina Ácida; [...] – Quantidade de cumarina (%) nos extratos e frações; [N/D] – Não detectado; (-) – Sem atividade.

TABELA 4 – Comparação da atividade antimicrobiana de extratos brutos de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt. & R.M. Sm. obtidos por decocção, tubólise e soxhlet com cumarinas sintéticas.

MICRORGANISMOS

EXTRATOS BRUTOS OBTIDOS POR DECOCÇÃO, TURBÓLISE E SOXHLET (2.000μg/disco) (halos em mm ± DV)

PADRÕES (halos em mm ± DV)

DECOCÇÃO TURBÓLISE SOXHLET CU1 CU2 CU3

(300μg/disco)

Kanamicina

(30μg/disco)

Cetoconazol

(300μg/disco) EBAE

[40,8]

EBE

[7,1]

EBM

[4,9]

EBAE

[34,1]

EBE

[30,3]

EBM

[14,0]

EBAE

[34,9]

EBE

[N/D]

EBM

[1,8]

S. aureus 13,0±1,2 - - 11,0±1,2 14,0±0,6 - 11,0±1,2 - - 21,0±0,0 - 16,0±0,0 28,0±0,0 -

B. subtilis 17,0±1,2 11,0±1,2 - 13,0±0,0 14,0±0,6 12,0±0,6 13,0±0,6 - - - - 12,0±0,0 29,0±0,0 -

E. faecalis 12,0±0,0 - - - 13,0±1,2 - 12,0±1,2 - - - - 14,0±0,0 13,0±0,0 -

M. luteus 13,0±0,6 - - 11,0±0,6 12,0±0,0 - 11,0±0,6 - - - - - 34,0±0,0 -

E. coli - - - - - - - - - - - - 15,0±0,0 -

P. aeruginosa - - - - - - - - - - - - 20,0±0,0 -

S. marcescens - - - - - - - - - - - - 15,0±0,0 -

M. smegmatis 15,0±0,6 - - 12,0±0,0 14,0±1,2 12,0±0,6 14,0±0,6 - - 12,0±0,6 - 15,0±1,2 40,0±0,0 -

C. albicans - - - - - - - - - - - - - 24,0±0,0

54

5.2 ARTIGO 2

TÍTULO: Relação da atividade citotóxica de extratos brutos e frações de Alpinia

zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. com cumarinas sintéticas

RESUMO

O presente trabalho objetivou comparar a atividade citotóxica de extratos brutos do

rizoma de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. e suas frações. A atividade

de cumarinas sintéticas, relacionando os resultados com os teores de cumarinas

neles presentes. Para isto, foram preparados extratos e frações do rizoma da

espécie, determinados os teores de cumarina por espectrofotometria, e testada

atividade citotóxica frente as células das linhagens HT-29, NCI-H292 e HEp-2

relacionando-se os resultados com os teores de cumarina neles contidos. Os

extratos brutos e frações que apresentaram o maior teor de cumarinas também

apresentaram citotoxicidade significativas frente à HT-29 e moderadas frente às

células NCI-H292. As cumarinas sintéticas foram moderadamente citotóxicas frente

às células HT-29 e não significativas frente às demais linhagens. A presença de

cumarina em grandes quantidades em A. zerumbet e a correlação positiva entre os

teores de cumarinas presentes nos extratos brutos e frações com a citotoxicidade,

sugere que a ingestão oral e o uso tópico da planta, tal como feito pela população

não está isenta de risco, mesmo considerando que a presença de cumarina foi maior

nos extratos produzidos com solventes de polaridade moderada, enquanto a

população a utiliza em extração aquosa.

PALAVRAS-CHAVE: Alpinia zerumbet; citotoxicidade; cumarinas.

55

INTRODUÇÃO

Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm (Zingiberaceae) é uma

planta muito utilizada pela população por seus aspectos farmacológicos tais como

ações anti-hipertensiva, diurética e febrífuga (LORENZI; SOUZA, 1995). A

composição química da espécie apresenta terpenóides, flavonoides e cumarinas em

suas folhas e rizoma (MPALANTINOS et al. 1998; ZOGHBI et al. 1999).

As cumarinas, possuem ações antioxidante, anti-inflamatória e

antimicrobriana comprovadas (TORRES et al. 2006; KALKHAMBKAR et al. 2008;

MENGHINI et al. 2010), sendo utilizadas na indústria alimentícia como flavorizantes,

uso este, que vêm sendo combatido, devido sua alta toxicidade que motivou a

proibição do seu uso farmacêutico e alimentício em vários países (COUMARIN,

2006; ARAUJO; ECHEVERRIA; PASTORE-JUNIOR, 2004).

O Mistério da Saúde em 2009 incluiu A. zerumbet na Relação Nacional de

Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS) (BRASIL, 2009), entretanto,

ressalta-se que o United States Food and Drug Administraion (FDA) desde 1954

proibiu o uso de cumarinas em alimentos para seres humanos e a sua importação. O

SCF (Scientific Comitte for Food) dos Estados Unidos após pesquisar a toxidez da

cumarina em 1994, concluíram que a cumarina foi carcinogênica para ratos quando

ingerida, por outro lado, no Brasil, o Decreto número 50.040, de 24 de janeiro de

1961 que dispõe sobre as normas técnicas especiais reguladoras do emprego de

aditivos químicos a alimentos, proibiu a adição de cumarinas aos flavorizantes por

esta, ser considerada uma substância prejudicial à saúde e a Farmacopéia Brasileira

indica a dose de 500 mg/dia como dose máxima para adultos (ARAUJO;

ECHEVERRIA; PASTORE-JUNIOR, 2004).

Devido ao grande uso popular de A. zerumbet, apontada como uma das

mais citadas por usuários do SUS de Cuiaba-MT (BIESKI, 2005) e entre as dez

plantas mais comercializadas nos mercados públicos da Região Metropolitana

Recife (ALBUQUERQUE et al. 2007) e a sua inclusão como Planta Medicinal de

Interesse ao SUS feita pelo Ministério da Saúde do Brasil em 2009, objetivou-se

neste estudo, comprovar a presença de cumarina na espécie, avaliar a presença de

citotoxicidade e correlacionar com os teores de cumarinas presentes nos extratos

brutos e frações testadas determinados por método espectrofotométrico, visando

alertar a comunidade cientifica e a população em geral para os possíveis riscos

56

decorrentes do uso indiscriminado da planta principalmente na forma de chás e

banhos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Derivados cumarínicos

Foi utilizado neste estudo comparativo a 1,2-benzopirona (1) da Sigma-

Aldrich (Figura 1) como padrão comercial e cumarinas sintetizadas no Laboratório de

Materiais Poliméricos e Caracterização do Departamento de Engenharia Química da

Universidade Federal de Pernambuco. A metodologia direta para a obtenção do

produto de partida selecionado para o desenvolvimento desse trabalho seguiu Costa

et al. (2008), tendo como reagentes de partida as substâncias 2-hidróxi-salicilaldeído

substituído (2) e a malononitrila (3), os quais reagem em condições brandas para dar

a 3-cianocumarina (4). Para a cumarina ácida (5) foi adicionado 0,80g de

malononitrila (12,5mmol) a 1,1mL de salicilaldeído (10mmol) em 50 mL de solução

de NaHCO3 0,05M e agitados a temperatura ambiente. Após 16h foi adicionado à

suspensão amarelada 2 mL de HClconc., a mistura reacional ficou em refluxo e sob

agitação a 90°C durante 2.5 h, sendo adicionado posteriormente 20 mL da solução

de NaHCO3 1M. A reação ficou em refluxo por 2h a 90°C. A mistura foi acidificada

com 2 mL de HClconc. ajustando o pH para ≤ 2. O material foi filtrado com auxilio de

funil de Büchner e lavado com água gelada.



57

Coleta vegetal

O rizoma fresco de A. zerumbet foi coletado em julho-2011 de uma horta

com cultivo padronizado do Laboratório de Fitoterapia do Instituto de Pesquisas

Agropecuárias de Pernambuco (IPA). O material foi seco a temperatura ambiente

por 15 dias e triturado em forrageira para posterior extração.

Preparação dos extratos

Extração com solvente orgânico

O material seco e triturado coletado em ambos os períodos foram postos

em maceração a exaustão com três trocas de solventes a cada sete dias para

produção de extratos brutos metanólico e acetônico utilizando 35g de planta seca

para 300 mL de solvente (ZELNIK et al. 1977). A partir do extrato metanólico

realizou-se extração líquido-líquido para fracionamento com solventes de

polaridades crescentes: hexano, diclorometano e butanol, a fim de extrair compostos

pela afinidade de polaridade com cada composto orgânico.

Adicionalmente, foram realizadas extrações por maceração, decocção,

turbólise e soxhlet com acetato de etila, etanol e metanol (Tabela 1).

Todos os extratos e frações obtidos foram evaporados à secura em

evaporador rotativo. Posteriormente, os extratos e frações foram armazenados em


fitoquímica e atividade citotóxica.

TABELA 1 – Metodologia de extração do rizoma de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. por maceração, decocção, turbólise e soxhlet.

Método de extração

Massa vegetal / Volume do solvente

Solventes Condições

Maceração 20 g / 500 mL Metanol Sete dias

Recipiente fechado Protegido da luz


Decocção 20 g / 200 mL Metanol Trinta minutos

Chapa de aquecimento Temperatura de ebulição


Turbólise ou turbo extração

20 g / 400 mL Metanol Três tempos de 5 min

Triturador industrial Temperatura ambiente


Soxhlet 15 g / 300 mL Metanol Seis horas

Extrator de Soxhlet Temperatura de ebulição


58


Para comprovar a presença de cumarinas nos extratos do rizoma de A.

zerumbet foram utilizados dois métodos: Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

utilizando eluente tolueno: eter (1:1 saturado com ácido acético 10%) e KOH

etanólico 10% para revelar a placa (MARKHAM, 1982; WAGNER, 1984) e o método

de quantificação espectrofotométrica (OSÓRIO; MARTINS, 2004).

Para a CCD as placas foram lidas em câmara escura com e sem

revelador. Sem revelador o método identifica presença de cumarinas com manchas

escuras quando visualizado em lâmpada ultravioleta com comprimento de onda de

254 nm e manchas azuis e verdes com comprimento de onda de 365 nm. Com

revelador, as manchas azuis ou azuis esverdeado mostraram presença de

cumarinas simples na amostra. Para interpretação dos resultados, foi atribuído

símbolos pela intensidade da mancha de identificação de cumarinas na amostra,

onde (+) corresponde a pouca, (++) moderada e (+++) alta concentração. Foi

utilizado como padrão a esculetina, 1,2-benzopirona e a cumarina ácida sintetizada

(Tabela 2).

TABELA 2 – Reagentes utilizados no método de identificação de cumarinas por cromatografia em camada delgada utilizando esculetina, 1,2-benzopirona e cumarina ácida como padrões (MARKHAM, 1982; WAGNER, 1984).

Metabólito Sistema Eluente

Padrões Revelador Detecção (λλλλ)

Cumarinas

Tolueno: éter (1:1 saturado

com ácido acético 10%)

Esculetina 1,2-benzopirona cumarina ácida

Sem Revelador

UV-254 nm: manchas escuras UV-365 nm: Azul, verde, amarelo e violeta-azulada

KOH etanólico 10%

UV-365 nm: azul e azul-esverdeado (cumarina simples); amarelo, azul e marrom (derivados)










59




Atividade Citotóxica

Para avaliação da citotoxicidade, foram utilizadas linhagens celulares

HEp-2 (derivada do tumor da laringe humana), NCI-H 292 (carcinoma

mucoepidermóide de pulmão) e HT-29 (carcinoma de cólon humano), obtida a partir

de banco de células do Rio de Janeiro, Brasil. As células foram mantidas em DMEM

- Meio Essencial Mínimo de Eagle modificado Dulbecco (Sigma), todas as linhas

celulares foram suplementados com 10% de soro fetal bovino (GIBCO), 1% solução

de antibiótico (penicilina 1000 UI/mL + estreptomicina a 250 µg/mL) e 1% de L-

glutamina 200 mM.

Para determinar a viabilidade celular, foi utilizado o corante vital Azul

Tripan (Merck) 0,4% p/v, em PBS, o qual penetra facilmente nas células danificadas

corando-as em azul, enquanto as células íntegras permanecem incolores, permitindo

assim, determinar-se a porcentagem de células vivas e células mortas

(WEISENTHAL, 1983).

A contagem das células foi realizada em microscópio invertido LEITZ, com

a utilização de um hemocitômetro, preenchido com uma alíquota da suspensão de

células homogeinizada.

Os testes de citotoxicidade foram realizados utilizando o ensaio de

redução do 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) (Sigma Aldrich

Co., St. Louis, MO/EUA). Para todas as experiências, as células tumorais foram

plaqueadas em placas de 96 poços (105 células/mL). Os compostos foram testados

na concentração de 50 µg/mL e dissolvidos em Dimetilsulfóxido (DMSO) a 1%,

incubou-se durante 72 h. Os grupos controle receberam a mesma quantidade de

DMSO. Após 69 h de tratamento, 25 µL de MTT (5 mg/mL) foi adicionado, três horas

mais tarde, os cristais de formazan foram dissolvido em 100 µL de DMSO e a

absorvância foi medida a 595 nm em placa espectrofotómetro. A densidade óptica

(DO) média dos poços foi comparada com a DO média dos poços controles

(MOSMANN, 1983; ALLEY, 1988)

Uma escala de intensidade foi utilizada para avaliar o potencial citotóxico

das amostras testadas. Amostras sem atividade (1 a 20% de inibição), com pouca

60

atividade (inibição de crescimento celular variando de 20 a 50%), com atividade

moderada (inibição de crescimento celular variando de 50 a 70%) e muito ativo

(inibição de crescimento variando de 70 a 100%)

RESULTADOS E DISCUSSÕES


Com base nos resultados obtidos pela Cromatografia em Camada

Delgada para identificação de presença ou ausência de cumarinas nos extratos

brutos e frações obtidas do rizoma de A. zerumbet (Figura 2), analisamos o

doseamento de cumarinas para a espécie. Os mesmos demonstraram um alto teor

para o extrato acetônico e todas as amostras extraídas por acetato de etila,

independente do método utilizado, seguido pelo etanol. A maceração, junto com a

turbólise foram os métodos que se destacaram na extração de cumarinas de A.

zerumbet, independente do solvente (Tabela 4).

Os dados referentes à curva de calibração da solução padrão de

cumarina encontram-se à Figura 3 e Tabela 3. Com um coeficiente de linearidade da

curva de calibração em 0,9904 indica que o método é linear quando aplicado à

substância pura (Brittain, 1998).

Cruz et al. (2009) em seus estudos com folhas de A. zerumbet também

identificaram por Cromatografia em Camada Delgada presença de cumarinas na

espécie.

61

FIGURA 2 – Placa cromatográfica para identificação de presença de cumarina nos extratos e frações obtidos de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm.

FIGURA 3 - Curva de calibração da solução padrão de cumarina, com leitura em 320 nm. Os valores são referentes à tabela 3.

Legenda: 1, 2 e 3 – Maceração metanólico, etanólico e acetato de etila; 4, 5 e 6 – Decocção metanólico, etanólico e acetato de etila; 7, 8 e 9 – Túrbólise metanólico, etanólico e acetato de etila; 10, 11 e 12 – Soxhlet metanólico, etanólico e acetato de etila; 13, 14 e 15 – Fração hexânica, diclorometano e butanólica; 16 – Extrato bruto acetônico; P – 1,2-benzopirona

62

TABELA 3 – Alíquotas utilizadas para formar a curva de calibração com solução padrão de cumarina

Número de Aliquotas

Concentração do padrão de cumarina em µg/mL

Leitura de Absorbância em 320 nm

1 0,4 0,043

2 1,0 0,082

3 4,0 0,135

4 8,0 0,280

5 12,0 0,416

TABELA 4 – Presença e teores de cumarinas por Cromatografia em Camada Delgada e doseamento por espectrofotometria nos extratos e frações secos obtidos do rizoma de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm.

Processo extrativo Solvente CCD Teor (%) ± DP CV%

Maceração

Acetato de Etila +++ 39,03 ± 3,720 9,53

Etanol Absoluto +++ 37,10 ± 6,736 18,16

Metanol P.A. + 11,29 ± 3,077 27,26

Fracionamento

(Extração Líquido-Líquido)

Hexano ++ 18,82 ± 0,930 4,94

Diclorometano + 5,70 ± 1,449 25,42

Butanol - 3,68 ± 0,526 14,29

Decocção

Acetato de Etila +++ 40,81 ± 3,878 9,50

Etanol Absoluto + 7,10 ± 1,613 22,73

Metanol P.A. + 4,95 ± 1,490 30,12

Turbólise

Acetato de Etila +++ 34,09 ± 0,672 1,97

Etanol Absoluto ++ 30,32 ± 2,812 9,27

Metanol P.A. + 13,98 ± 4,033 28,85

Soxhlet

Acetato de Etila +++ 34,95 ± 1,490 4,26

Etanol Absoluto - N/D N/D

Metanol P.A. + 1,77 ± 0,684 38,57

Legenda: (+, ++, +++) – Intensidade da mancha de cumarina na placa cromatográfica; (-) – ausência de cumarina nas amostras DP – Desvio-Padrão; CV – Coeficiente de Variação; N/D – Não detectado.

63

Atividade Citotóxica

Os resultados de atividade citotóxica dos extratos brutos e frações

testadas frente às linhagens celulares HT-29 e NCI-H292 mostraram resultados de

moderado a leve ação citotóxica na concentração de 50 µg/mL, também para as

cumarinas analisadas que apresentaram ação moderada frente a essas linhagens.

(Tabela 5 e 6).

As cumarinas foram moderadamente ativas frente a HT-29 e NCI-H292,

com percentuais de inibição iguais a 70 e 55,5% para a cianocumarina e 65 e 50,6%

para a cumarina ácida, respectivamente.

Os extratos brutos extraídos com acetato de etila, tanto por maceração,

quanto por decocção, turbólise e soxhlet foram os mais ativos frente as linhagens

celulares testadas, apresentando percentuais de inibição variando entre 78,4% para

o extrato bruto obtido por soxhlet frente a HT-29 a 31,2% para o extrato obtido por

turbólise frente a NCI-H292.

A extração com acetona também mostrou atividade moderada frente as

linhagens HT-29, NCI-H292 e HEp-2 com percentuais de inibição iguais a 76,8, 57,9

e 55,9%, respectivamente.

64

Legenda: EBAE, EBE e EBM – extrato bruto acetato de etila, extrato bruto etanólico e extrato bruto metanólico; FHe, FD e FB – fração hexânica, fração diclorometano e fração butanólica; CU1 – 1,2-benzopirona (Sigma-Aldrich), CU2 – Cianocumarina, CU3 – Cumarina Ácida; [...] – Quantidade de cumarina (%) nos extratos e frações; [N/D] – Não detectado; (-) – Sem atividade.

TABELA 5 – Percentual de Inibição obtido para extratos brutos e frações de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. obtidos por maceração frente a linhagens celulares.

LINHAGENS CELULARES

EXTRATOS BRUTOS E FRAÇÕES OBTIDOS POR MACERAÇÃO

(Percentual de Inibição Celular na Concentração de 50 µg/mL)

PADRÕES (Percentual de Inibição Celular na

Concentração de 50 µg/mL)

EBAE

[39,0]

EBE

[37,1]

EBM

[11,3]

FHe

[18,8]

FD

[5,7]

FB

[3,7] CU1 CU2 CU3

HT-29 75,6 75,5 - 38,4 42,8 - - 70,0 65,0

NCI-H292 52,5 44,3 - 40,0 46,4 - - 55,5 50,6

HEp-2 58,4 56,2 - 43,6 46,4 - - 40,4 39,2

65

Legenda: EBAE, EBAE e EBM – extrato bruto acetato de etila, extrato bruto etanólico e extrato bruto metanólico; CU1 – 1,2-benzopirona (Sigma-Aldrich), CU2 – Cianocumarina, CU3 – Cumarina Ácida; [...] – Quantidade de cumarina (%) nos extratos e frações; [N/D] – Não detectado; (-) – Sem atividade.

TABELA 6 – Percentual de Inibição obtido para extratos brutos de Alpinia zerumbet (Pers.) B.L. Burtt & R.M. Sm. obtidos por decocção, turbólise e soxhlet frente a linhagens celulares.

LINHAGENS CELULARES

EXTRATOS BRUTOS OBTIDOS POR DECOCÇÃO, TURBÓLISE E SOXHLET

(Percentual de Inibição Celular na Concentração de 50 µg/mL)

PADRÕES (Percentual de Inibição Celular na Concentração de 50 µg/mL)

DECOCÇÃO TURBÓLISE SOXHLET

CU1 CU2 CU3 EBAE

[40,8]

EBE

[7,1]

EBM

[4,9]

EBAE

[34,1]

EBE

[30,3]

EBM

[14,0]

EBAE

[34,9]

EBE

[N/D]

EBM

[1,8]

HT-29 75,7 31,1 - 77,3 60,8 - 78,4 - 9,0 - 70,0 65,0

NCI-H292 74,3 21,9 - 31,2 40,5 - 68,3 - 50,9 - 55,5 50,6

HEp-2 54,0 44,8 - 55,7 55,6 - 59,4 - 11,4 - 40,4 39,2

66

Nos nossos estudos, o extrato bruto metanólico obtido por maceração,

decocção e turbólise não apresentou atividade citotóxica, mostrando apenas uma

ação moderada frente a NCI-H292 com percentual de inibição igual a 50,9%.

Corroborando com nossos estudos, Corrêa e Costa (2008), também avaliaram a

ação citotóxica do extrato bruto metanólico do rizoma de A. zerumbet obtido por

maceração e não encontraram citotoxicidade significativa frente a NCI-H292 e

HEp-2.

As frações hexânica e diclorometano apresentaram leve atividade

citotóxica frente a HT-29, NCI-H292 e HEp-2 com percentuais de inibição iguais a

38,4, 40,0 e 43,6% para a fração hexânica e 42,8, 46,4 e 46,4% para a fração

diclorometano, respectivamente. Já nos estudos de Corrêa et al. (2009), onde

também avaliaram a atividade citotóxica de frações do rizoma de A. zerumbet frente

a NCI-H292 e HEp-2, encontraram alta atividade para estas frações, CI50 de 21 e 12

µg/mL para a fração hexânica, respectivamente. Foram encontradas CI50 de 29

µg/mL para a fração diclorometano frente a NCI-H292.

Oliveira (2008) também avaliou ação citotóxica dos óleos essenciais e

extrato aquoso das folhas de A. zerumbet frente a diversas linhagens celulares e

não encontraram atividade citotóxica significativa para a espécie.

Susidarti et al. (2009) avaliaram a atividade citotóxica de derivados

cumarinicos isolados de Micromelum minutum frente a CEM-SS, HL-60 e HeLa

encontrando alta ação citotóxica com CI50 variando entre 2,5 a 5,9μg/mL, assim

como, Kostova et al. (2005) e Shafiee et al.(2010) que também avaliando a

citotoxicidade de derivados cumarínicos sintetizados encontraram atividade

moderada para suas moléculas.

Foram observados nos extratos brutos e frações que obtiveram maiores

ações citotóxicas foram aqueles que também apresentaram altos teores de

67

cumarina, bem como, a célula HT-29 e NCI-H292 que foram as células mais

sensíveis aos extratos brutos e frações também foram a linhagens mais sensíveis a

estas lactonas.

CONCLUSÃO

Podemos concluir que na A. zerumbet há presença de cumarinas em seu

rizoma e os testes de citotoxicidade foram positivos para alguns extratos e frações,

assim como, para as cumarinas sintéticas analisadas. Tambem foi observado, uma

possível ligação da quantidade de cumarina presente em cada extrato com sua ação

citotóxica. Devido ao largo uso da espécie por seus aspectos farmacológicos, sua

ingestão oral e uso tópico, não estão isentos de riscos, mesmo considerando que a

presença de cumarina foi maior nos extratos produzidos com solventes de

polaridade moderada, enquanto a população a utiliza em extração aquosa. Novos

estudos deverão ser realizados utilizando água como solvente extrator para

fundamentar mais este alerta para a população.

68

REFERÊNCIAS

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71

6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Os resultados encontrados em nosso estudo vão informar a população e

comunidade científica a importância nos cuidados com a coleta de plantas

medicinais, sobretudo na parte de efeitos que a sazonalidade pode ocasionar na

planta, desde alteração no rendimento do extrato, até a síntese de metabolitos

secundários, ocasionando com isto, problemas em seus aspectos tóxicos.

Estes aspectos foram analisados mediante a presença da Cumarina que

em vários países sua adição alimentícia já foi suspensa ou proibida. Em nossos

estudos houve correlação entre a presença de cumarina e as ações antimicrobiana e

citotóxica dos extratos brutos e frações, porém, essa correlação foi mais acentuada

para os ensaios de citotoxicidade. Isto sugere que a ingestão oral e uso tópico de A.

zerumbet, tal como feito pela população não está isenta de risco mesmo

considerando que a presença de cumarina foi maior nos extratos produzidos com

solventes de polaridade moderada. Faz-se, portanto, necessário investigar a

presença de cumarinas em extratos aquosos e promover a concientização do uso

racional da espécie de modo a minimizar possíveis danos provenientes do seu uso

de forma inadequada.

Para isto, já preparamos extratos brutos aquosos e iremos identificar o

teor de cumarinas nele contido e avaliar sua atividade antimicrobiana e

principalmente citotóxica, como forma de complementar o estudo e dar mais

subsídios a nossa indicação de cuidado no uso da espécie.

Os resultados encontrados para a fração hexânica obtida do extrato bruto

metanólico coletado no período chuvoso nos remete forte esperança em identificar-

mos o principio ativo desta que causou alta sensibilidade frente ao microrganismo C.

albicans, novos estudos deverão ser realizados para esta amostra, como nova

coleta em período chuvoso para certificação desta atividade, assim como, coletar a

espécie em diversos períodos do ano para identificar a época de aumento do

principio ativo, isolamento dos compostos ativos por métodos cromatográficos,

testes em cepas de isolados clínicos de Candidas, entre outras ações para

identificação de um novo antifúngico.

72

REFERÊNCIAS

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WAGNER, H.; BLADT, S.; ZGAINSKI, E.M. 1984. Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas. 1ª ed. Berlim: Springer Verlag. 320p.

WANG, Y.C.; HUANG, T.L. Screening of anti-Helicobacter pylori herbs deriving from Taiwanese folk medicinal plants. FEMS Immunol Medicine Microbiol, v. 43, n. 2, p. 295-300, 2005.

WATTIEZ, N.; STERNON, F. Élements de chemie végétale. 2 ed. Paris: Masson et Cie. 1942. 844p.

WEISENTHAL, L. M. et al. A novel dye exclusion method for testing in vitro chemosensitivity of human tumors. Câncer Research XVI, v. 43, p. 749 – 757, 1983.

WONG, L.F. et al. Antioxidant and antimicrobial activities of some Alpina species. Journal of Food Biochemistry. v. 33, n. 6, p. 835-851. 2009.

81

XU, H; DONG, H.; SIM, K. Labdane diterpenes from Alpinia zerumbet. Phytochemistry (Oxford), Singapura, v. 42, n. 1, p. 149-151. 1996.

YU, B. et al. Comparative studies on bioactivities of the resources plants of Fructus amomi. Journal of Plant Resources and Environment, Nanjing, v. 2, n. 3, p. 18-23. 1993.

YUAN-YING, W. et al. A new diterpenoid from Alpinia zerumbet. Acta Botanica Sinica. v. 39, p. 983-4. 1997.

ZHAO, H. et al. Coumarin-Based Inhibitors of HIV Integrase. Journal of Medicinal Chemistry. v. 40, n. 2, p. 242-249. 1997

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82

ANEXO A - NORMAS DE PUBLICAÇÃO DA REVISTA QUÍMICA NOVA

NORMAS DE PUBLICAÇÃO

GERAL - Serão considerados para publicação na Revista Química Nova manuscritos que cubram as áreas

tradicionais da Química bem como artigos sobre Ensino de Química, História da Química, Política Científica, etc,

além de artigos de áreas afins, desde que tenham acentuado conteúdo químico. Os trabalhos devem se encaixar

dentro de uma das modalidades abaixo:

Artigos Originais (em português, inglês ou espanhol): refere-se a trabalhos inéditos de pesquisa. Devem

seguir a forma usual de apresentação, contendo Introdução, Resultados e Discussão, Parte Experimental etc, de

acordo com as peculiaridades de cada trabalho.Deverão ter no máximo 25 páginas, incluindo figuras, tabelas,

esquemas, etc e todas as páginas deverão ser numeradas.

Artigos de Revisão (em português, inglês ou espanhol): destinados à apresentação do progresso em uma área

específica de Química, com o objetivo de dar uma visão crítica do estado da arte do ponto de vista do

especialista altamente qualificado e experiente. Deverão ter no máximo 40 páginas, incluindo figuras, tabelas,

esquemas, etc e todas as páginas deverão ser numeradas.

É imprescindível que, na referida área, o autor tenha publicações que comprovem a sua experiência e

qualificação. Antes do envio do manuscrito, o autor deverá submeter à editoria, por e-mail, um resumo da

revisão pretendida, acompanhado de uma carta explicativa da pertinência do trabalho. O material será analisado

pelos Editores e, uma vez aprovado, será solicitado ao autor o envio do manuscrito completo, dentro das normas

de QN, e só então será dado início ao processo de avaliação pelos assessores.

O Corpo Editorial de QN poderá, eventualmente, convidar pesquisadores qualificados para submeter artigo de

revisão.

Artigos sobre Educação (em português ou espanhol): trabalhos de pesquisas relacionadas ao ensino de

Química e divulgação de experiências inovadoras no ensino de graduação e pós-graduação.Deverão ter no

máximo 25 páginas, incluindo figuras, tabelas, esquemas, etc e todas as páginas deverão ser numeradas.

Notas Técnicas (em português, inglês ou espanhol): trabalhos de comunicação de métodos, validação de

métodos, técnicas, aparelhagens ou acessórios desenvolvidos no laboratório de origem do autor do

manuscrito. Deverão ter no máximo 25 páginas, incluindo figuras, tabelas, esquemas, etc e todas as páginas

deverão ser numeradas.

Assuntos Gerais (em português, inglês ou espanhol): abordagem de assuntos de interesse geral dos químicos,

tais como política científica, programas de graduação e pós-graduação, história da química. etc.Deverão ter no

máximo 40 páginas, incluindo figuras, tabelas, esquemas etc. e todas as páginas deverão ser numeradas.

PREPARAÇÃO DE MANUSCRITOS - Todos os trabalhos deverão ser digitados em espaço duplo, utilizando

somente Microsoft Word. A seguir, deve ser gerado um único arquivo no formato .pdf, do trabalho todo, para ser

83

submetido através do sistema on line de QN. A revista não aceita mais a submissão de trabalhos por outra

forma.

A primeira página deverá conter o título do trabalho, nome e endereço dos autores. Havendo autores com

diferentes endereços, estes deverão vir imediatamente após o nome de cada autor. Os autores deverão ser

agrupados por endereço. O autor para correspondência, que deverá ser o mesmo que submete o artigo on line,

deverá ser indicado com asterisco (*) e seu e-mail colocado no rodapé da página (um só e-mail).

A segunda página deverá conter o título e o resumo do trabalho em inglês (abstract), com no máximo 100 (cem)

palavras, e a indicação de 3 palavras-chave (keywords), também em inglês.

As figuras (incluindo gráficos, esquemas, etc) deverão ser em número máximo de 7 figuras simples e ter

qualidade gráfica adequada (usar somente fundo branco). Para número maior ver o item Material Suplementar.

As figuras, tabelas, esquemas, etc deverão ser colocadas após as referências e devidamente identificadas pelo

respectivo número. Se escaneadas, deverão ser em alta resolução (800 dpi/bitmap para traços).. No caso

particular de esquemas contendo estruturas químicas, estas deverão ter sempre a mesma dimensão, para que

possam ser reduzidas uniformemente, além de boa qualidade gráfica. Considerar que as figuras deverão ter

largura máxima de uma coluna (8,5 cm).

Figuras coloridas terão custo de publicação repassado aos autores, quando da publicação. Esse valor só poderá

ser informado aos autores quando o trabalho estiver previsto para ser publicado, ocasião em que a gráfica

fornece o orçamento.

Para figuras, gráficos, esquemas, tabelas, etc idênticos aos já publicados anteriormente na literatura, os autores

deverão pedir permissão para publicação junto à empresa/sociedade científica que detenha os direitos autorais e

enviá-la à editoria de QN junto com a versão final do manuscrito.

As referências deverão ser numeradas consecutivamente no texto, na forma de expoentes, após a pontuação (se

houver). A lista de referências deverá ser colocada no final do texto. As legendas das figuras, gráficos e

esquemas deverão ser colocadas em uma única folha à parte, separadas das figuras. A seguir, deverão ser

colocadas as figuras, os gráficos, os esquemas, as tabelas e os quadros. Colocar os títulos acima de cada tabela.

No texto, deverá ser indicada apenas a inserção de cada um(a).

Referências

Revistas:

Será utilizada a abreviatura da revista como definida no Chemical Abstracts Service Source Index

(ver http://www.cas.org/sent.html). Caso a abreviatura autorizada de uma determinada revista não

puder ser localizada e não for óbvio como o título deve ser abreviado, deve-se citar o título

completo.

1. Varma, R. S.; Singh, A. P.; J. Indian Chem. Soc. 1990, 67, 518.

2. No caso especial da revista citada não ser de fácil acesso, é recomendado citar o seu número de

Chemical Abstract, como segue:

84

Provstyanoi, M. V.; Logachev, E. V.; Kochergin, P. M.; Beilis, Y. I.; Izv. Vyssh. Uchebn. Zadev.;

Khim. Khim. Tekhnol. 1976, 19, 708. (CA 85:78051s).

3. Caso o trabalho tenha doi, mas não a referência completa, citar doi da seguinte maneira:

Vidotti, M.; Silva, M. R.; Salvador, R. P.; de Torresi, S. I. C.; Dall'Antonia, L. H.;Electrochimica Acta (2007), doi:10.1016/j.electacta.2007.11.029.

É recomendado o uso de referências compostas na medida do possível, em lugar de uma lista de referências individuais. O estilo das referências compostas é o seguinte:

4. Varela, H.; Torresi, R. M.; J. Electrochem. Soc. 2000, 147, 665; Lemos, T. L. G.; Andrade, C. H. S.; Guimarães, A. M.; Wolter-Filho, W.; Braz-Filho, R.; J. Braz. Chem. Soc. 1996, 7, 123; Ângelo, A. C. D.; de Souza, A.; Morgon, N. H.; Sambrano, J. R.; Quim. Nova 2001, 24, 473.

Patentes:

Devem ser identificadas da seguinte forma (na medida do possível o número do Chemical Abstracts deve ser informado entre parênteses).

5. Hashiba, I.; Ando, Y.; Kawakami, I.; Sakota, R.; Nagano, K.; Mori, T.; Jpn. Kokai Tokkyo Koho 79

73,771 1979. (CA 91:P193174v) 6. Kadin, S.B.; US pat. 4,730,004 1988. (CA 110:P23729y) 7. Eberlin, M. N.; Mendes, M. A.; Sparrapan, R.; Kotiaho, T. Br PI 9.604.468-3,1999.

Livros:

com editor(es):

8. Regitz, M. Em Multiple Bonds and Low Coordination in Phosphorus Chemistry; Regitz, M.; Scherer, O. J., eds.; Georg Thieme Verlag: Stuttgart, 1990, cap. 2.

sem editor(es):

9. Cotton, F.A.: Wilkinson, G.; Advanced Inorganic Chemistry, 5th ed., Wiley: New York, 1988.

Programas de computação (Softwares):

10. Sheldrick, G. M.; SHELXL-93; Program for Crystal Structure Refinement; Universidade de Göttingen, Alemanha, 1993.

Teses:

11. Velandia, J. R.; Tese de Doutorado, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Brasil, 1997.

Material apresentado em Congressos:

12. Ferreira, A. B; Brito, S. L.; Resumos da 20a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Poços de Caldas, Brasil, 1998.

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Páginas Internet:

http://www.sbq.org.br/jbcs, acessada em Junho 2001.

Material não publicado:

Para material aceito para publicação: Magalhães, U. H.; J. Braz. Chem. Soc., no prelo. Para material submetido mas ainda não aceito: Magalhães, U. H.; J. Braz. Chem. Soc., submetido. Para trabalho não publicado ou comunicação pessoal: Magalhães, U. H.; trabalho não publicado ou Magalhães, U. H., comunicação pessoal. Os resultados não publicados só poderão ser citados com a permissão explícita das pessoas envolvidas na sua obtenção.

Os autores devem procurar seguir, naquilo que for possível, as normas recomendadas pela IUPAC, inclusive o

Sistema Internacional de Unidades. Sobre a nomenclatura de compostos (orgânicos e inorgânicos) já há

traduções para a língua portuguesa publicadas em QN. Quanto aos Símbolos e Terminologias, onde não há

tradução, espera-se que adaptação seja feita pelos autores, criando então, paulatinamente, um conjunto de

normas em português.

SUBMISSÃO DOS ARTIGOS – A QN oferece aos autores a submissão on line, que pode ser acessada através

do registro de Login e Senha. É possível registrar-se em nossa home page

(http://quimicanova.sbq.org.br) usando a opção Novo Usuário.Usuários da plataforma do JBCS,

já estão cadastrados na base (pois ela é comum às duas revistas), devendo utilizar o mesmo Login e Senha.

Após estar cadastrado no sistema, o autor pode facilmente seguir as instruções fornecidas na tela. Será

solicitada asubmissão de um único arquivo do manuscrito completo, em formato .pdf. Está disponível uma

ferramenta para gerar o arquivo .pdf, a partir de arquivo .doc ou .rtf, com envio automático para o e-mail do

autor. Tão logo seja completada a submissão, o sistema informará automaticamente, por e-mail, o código

temporário de referência do manuscrito, até que este seja verificado pela editoria. Então será enviado e-mail

com o número de referência do trabalho.

Se não for recebido o e-mail com código de submissão temporária, por algum motivo, a submissão não foi

completada e o autor terá prazo máximo de 5 (cinco) dias para completá-la. Depois desse prazo, o sistema não

permite o envio, devendo ser feita nova submissão.

O autor poderá acompanhar, diretamente através do sistema, a situação de seu manuscrito.

Ao fazer a submissão, solicita-se uma carta de apresentação, que deverá ser digitada no local indicado, sendo

obrigatória a apresentação dos e-mails de todos os autores. Além disso, devem ser enviados também os nomes,

instituições a que pertencem e e-mails de três ou quatro possíveis assessores, que não podem pertencer à(s)

mesma(s) instituição(ões) dos autores.

Material Suplementar – Esta modalidade foi criada para que na versão impressa da revista apareça o número

estritamente necessário de figuras e tabelas (6 a 7 figuras simples). Ressalta-se que, como este material ficará

disponível apenas na versão on line, figuras, tabelas e ilustrações coloridas apresentadas na forma de material

suplementar não terão custo repassado aos autores, nem limite de páginas. Porém, devem ter boa qualidade

gráfica.

O material suplementar deverá ser colocado no final do trabalho, com indicação clara. Deverá ser submetido um

86

único documento .pdf, incluindo o material suplementar.

Os Editores poderão solicitar aos autores, em qualquer fase da tramitação, a separação de Material Suplementar.

MANUSCRITOS REVISADOS – Manuscritos enviados aos autores para revisão deverão retornar à Editoria

dentro de prazo máximo de trinta dias ou serão considerados retirados, sendo que o sistema encerra o processo,

não permitindo que seja reaberto. Vencido o prazo, deverá ser feita nova submissão, dando início a um novo

processo.

A submissão do manuscrito revisado deverá ser feita pelo mesmo autor, usando o Login e a Senha registrados

anteriormente. O autor deve seguir as instruções fornecidas na tela, para envio do documento .pdf completo da

versão revisada e das respostas aos assessores, detalhando as alterações feitas na nova versão e justificando as

alterações sugeridas nos pareceres e que não foram aceitas pelos autores. Esses dois arquivos devem ser

enviados através da seção Envio de Nova Versão, na Página do Autor, no sistema de submissãoon line de QN.

Tão logo seja completada a submissão o sistema informará automaticamente, por e-mail, o código temporário de

referência do manuscrito, até que ele seja verificado pela editoria. Então será enviado e-mail contendo o número

de referência do trabalho.

Se não receber o e-mail com código de submissão temporária, por algum motivo, a submissão não foi

completada e o autor terá prazo máximo de 5 (cinco) dias para completá-la. Depois desse prazo, o sistema não

permite o envio, devendo ser feita nova submissão.

O autor poderá acompanhar, diretamente através do sistema, o status de seu manuscrito.

VERSÃO FINAL – Quando for solicitada a versão final, o autor receberá instruções específicas quanto a

programas para envio de arquivos (texto, figuras, tabelas, etc) . Arquivos em formato .pdf não são mais

solicitados nessa fase.

Se as Figuras forem escaneadas, deverão ser em alta resolução (800 dpi/bitmap para traços) com

extensão tif ou jpg, desde que nas dimensões especificadas pelos Editores. As fotos ou desenhos com cor (300

dpi/grayscale) deverão ser enviadas com extensão tif/jpg, com largura máxima total de 8,5 cm para não haver

problemas ao aplicá-las no padrão da Revista. Outras extensões possíveis: cdr, eps, cdx ou opj. No caso

particular de esquemas contendo estruturas químicas, estas deverão ter sempre a mesma dimensão, para que

possam ser reduzidas uniformemente.

A Editoria de QN reserva-se o direito de efetuar, quando necessário, pequenas alterações nos manuscritos, de

modo a adequá-los às normas da revista ou tornar seu estilo mais claro, respeitando, naturalmente, o conteúdo

do trabalho. Qualquer que seja a natureza do manuscrito submetido, ele deve ser original em nível de

metodologia, informação, interpretação ou crítica. A qualificação do trabalho será atestada por dois consultores,

indicados pela Editoria.

87

Copyright ©2010 Sociedade Brasileira de Química

Para publicação, requer-se que os manuscritos submetidos a esta revista não

tenham sido publicados anteriormente e não sejam submetidos ou publicados

simultaneamente em outro periódico. Ao submeter o manuscrito, os autores

concordam que o copyright de seu artigo seja transferido à Sociedade Brasileira de

Química (SBQ), se e quando o artigo for aceito para publicação. O copyright

abrange direitos exclusivos de reprodução e distribuição dos artigos, inclusive

separatas, reproduções fotográficas, microfilmes ou quaisquer outras reproduções

de natureza similar, inclusive traduções. Nenhuma parte desta publicação pode ser

reproduzida, armazenada em bancos de dados ou transmitida sob qualquer forma

ou meio, seja eletrônico, eletrostático, mecânico, por fotocópia, gravação, mídia

magnética ou algum outro modo, sem permissão por escrito da detentora do

copyright. Embora todo esforço seja feito pela SBQ, Editores e Conselho Editorial

para garantir que nenhum dado, opinião ou afirmativa errada ou enganosa

apareçam nesta revista, deixa-se claro que o conteúdo dos artigos e propagandas

aqui publicados são de responsabilidade, única e exclusiva, dos respectivos

autores e anunciantes envolvidos. Conseqüentemente, a SBQ, o Conselho

Editorial, os Editores e respectivos funcionários, diretores e agentes isentam-se,

totalmente, de qualquer responsabilidade pelas conseqüências de quaisquer tais

dados, opiniões ou afirmativas erradas ou enganosas.

allan jonathan chernichiarro corrÊa · cumarinas presentes nos extratos brutos e frações...

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