actas bioquimica vol1 calmodulina
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Actas Bioq. 1989; 1:15-25 15
CALMODULINA E ATP-ase DO CÁLCIO
Carlota Saldanha
Instituto de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Lisboa
RESUMO
O processo de contracção do músculo esquelético inicia-se com a libertação de
cálcio existente no retículo sarcoplásmico despolarizado, após excitação
nervosa. Os iões cálcio ligam-se à troponina C e as alterações conformacionais
ocorridas no complexo resultante transmitem-se às moléculas de tropomiosina
e actina, possibilitando a interacção actina-miosina conducente à contracção
muscular. O relaxamento muscular ocorre por repolarização da membrana do
retículo sarcoplásmico, acompanhada de influxo de Ca2+
mediado pela bomba
de Ca2+
(actividade ATPase). A calmodulina (CaM) é uma proteína receptora
de Ca2+
para o qual possui alta afinidade (Kd 10-6
M) e especificidade, que
intervém na contracção e relaxamento musculares de modos directo e indirecto,
respectivamente. O primeiro processo refere-se à interacção miosina-actina,
que é facilitada pela fosforilação das cadeias leves de miosina na presença da
proteína-cinase (da cadeia leve da miosina) dependente de Ca2+
e calmodulina.
A fosforilação da cadeia leve da miosina (extremidade globular) induz
alterações conformacionais nesta ("cabeça"), favoráveis à ligação com a actina.
A acção indirecta da calmodulina manifesta-se pela calsequestrina (proteína da
membrana interna do retículo sarcoplásmico) que apresenta propriedades de
proteína-cinase dependente da calmodulina, e está envolvida na regulação da
actividade enzimática da ATPase Ca2+
Mg2+
. As alterações conformacionais
existentes na ATPase Ca2+
Mg2+
(que ocorrem na interconversão da enzima
entre dois estados) e nas proteínas tropomiosina e actina, estão associadas às
funções biológicas de relaxamento e contracção musculares.
Palavras-chave: Conformação proteica, calmodulina, calsequestrina, ATPase Ca2+
Mg2+
,
fosforilação
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ABERTURA DOS CANAIS DE CÁLCIO POR ESTIMULAÇÃO NERVOSA
A propagação do impulso nervoso na placa motora induz despolarização na membrana
externa da fibra muscular. A passagem do potencial de acção resultante para o interior da fibra
muscular é mediada pelos túbulos T que transmitem um sinal A cisterna terminal, com
consequente abertura dos canais de Ca e saída do ião para o espaço mioplásmico (ou
sarcoplasma). Eizenberg (1) confirmou o mecanismo molecular explicativo da natureza do sinal
proposto por Fransini-Armstrong e Nunzi (2) e Shneider e Chandler (3), que consiste na indução
de alterações conformacionais numa enzima localizada na cisterna terminal com prolongamento
pelo túbulo T, (proteína juncional) pelos factores variação do potencial de membrana e
movimento de carga ocorrentes na membrana do túbulo T (Fig. 1). O produto resultante da acção
catalítica da enzima é um efector actuante nos canais de saída de cálcio, situados na cisterna
terminal.
FIGURA 1
a) Esquema estrutural de junções intracelulares constituídas entre regiões de cisterna terminal do
retículo sarcoplásmico que ladeiam um túbulo transverso T no músculo esquelético. b)
Ampliação de uma junção celular: aquando da despolarização do túbulo transverso T ocorrem
alterações conformacionais nos receptores localizados na membrana deste as quais são
transmitidas à proteína funcional com subsequente abertura dos canais de cálcio.
Outros mecanismos têm sido sugeridos, baseados no aumento da concentração de
Ca2+
citoplásmico como indutor da abertura dos canais (4).
ACÇÃO BIOLÓGICA DO Ca2+
INTRACELULAR
SALDANHA C.
17
O aumento da concentração, de cálcio no sarcoplasma esta associado A contracção
muscular por estimulação de processes sequenciais, que envolvem (i) interacções do ião cálcio
com moléculas de troponina C com consequente alteração conformacional desta proteína, (ii)
que é transmitida às moléculas de tropomiosina e actina, (iii) facilitando a posterior ligação à
actina da molécula de miosina (com actividade ATPásica), e inicio de contracção muscular (Fig.
2).
Segue-se o relaxamento muscular, por repolarização da membrana do retículo
sarcoplásmico e reposição dos níveis de Ca2+
no interior da cisterna terminal, à custa de um
processo activo mediado pela bomba de cálcio do retículo sarcoplásmico (caracterizado por
actividade ATPásica). Adicionalmente, a calsequestrina localizada na membrana externa do
lúmen da cisterna terminal contribui para a manutenção dos níveis normais de cálcio dentro do
retículo sarcoplásmico.
FIGURA 2
O processo de contracção do músculo esquelético induzido por estimulação nervosa
consiste no movimento dos filamentos finos (I) e grossos (A) resultante da ocorrência de
alterações conformacionais das proteínas (miosina, actina, tropomiosina e troponina) induzidas
pelo ião cálcio.
O processo bioquímico de contracção/relaxamento musculares requer a participação do
ião cálcio nas etapas de transporte passivo (canais de Ca2+
) e activo (ATPase Ca2+
) e da
interacção com as proteínas troponina e calsequestrina.
O ião cálcio intracelular ocorre em baixas concentrações (10-7
M a 10-8
M) e apresenta
propriedades atómicas (raio iónico e número de coordenação) que contribuem para o exercício
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da função biológica de segundo mensageiro com características de universal, mercurial,
sincrónico e cominatório (5).
A concentração de cálcio intracelular pode ser alterada em alguns tecidos por um
processo dependente da renovação metabó1ica dos fosfoacilinositois, que são desdobrados pela
acção da fosfolipase C em inositol trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DG) (6). O IP3 induz a
mobilização do Ca2+
dos organelos intracelulares para o citoplasma e estimula as proteínas-
cinases dependentes da calmodulina; o diacilglicerol activa a proteína-cinase C (6). Assim, as
proteínas cinases activadas intervêm em reacções de fosforilação de proteínas intracelulares que
consequentemente participam nos processes conducentes à resposta celular - imediata
(dependente de IP3) e/ou sustida (dependente do DG) - ao estímulo inicial.
O grau de fosforilação das cadeias leves de miosina aumenta proporcionalmente à
frequência de contracção do músculo esquelético (7). No entanto, há discordância quanto ao
envolvimento do inositol-trifosfato na regulação da contracção do músculo esquelético (8, 9, 10).
Meyer (11) sugeriu que o ião cálcio, para exercer a acção de segundo mensageiro,
necessita da presença de proteínas ligantes. A primeira calciproteína a ser descoberta foi a
troponina C (12), seguida da calmodulina, cuja origem e composição da palavra estão ligadas a
Sheung e Kakinchi (13).
CARACTERIZAÇÃO DA MOLÉCULA DE CALMODULINA
A calmodulina (CaM) regula a concentração intracelular do cálcio em vários tecidos e
medeia múltiplas funções do ião actuando em enzimas-chave de sistemas de transporte e
sequências metabó1icas (proteína-cinases e fosfatases) (14-17). O Quadro 1 apresenta exemplos
de cé1ulas e/ou tecidos onde se localiza e actua a calmodulina (5, 16, 17).
QUADRO 1
EXEMPLOS DE ALGUNS PROCESSOS BIOLOGICOS MEDIADOS PELA
CALMODULINA
________________________________________________________________
LOCALIZAÇÃO PROCESSOS BIOLOGICOS
________________________________________________________________
Membranas pós-sinápticas Libertação de neurotransmissores
Espermatozóides Fertilização do óvulo
Células epiteliais do intestino Contractilidade muscular
Metabolismo do glicogénio
Fígado Metabolismo do glicogénio
Pâncreas Secreção da insulina
Coração, Cérebro Metabolismo dos nucleótidos
Cromossomas Mitose-polimerização e despolimerização dos
microtúbulos
________________________________________________________________
A calmodulina apresenta características acídias, estrutura terciária (18) com quatro locais
de ligação ao cálcio (19), cujo preenchimento pode ser parcial e/ou total (5) (Fig. 3).
SALDANHA C.
19
FIGURA 3
Representação esquemática do preenchimento dos quatro locais de ligação existentes na
molécula monomérica de calmodulina (CaM) pelos iões cálcio e consequentemente alteração
conformacional para a forma de monómero activo (Ca CaM).
Apesar do elevado número de estudos experimentais efectuados, para esclarecer o
processo de ligação cálcio/calmodulina, mantêm-se a controvérsia entre dois modelos que
propõem a existência na molécula de calmodulina de quatro centros de ligação, com afinidade
semelhantes ou dois pares de centros com afinidade distinta.
Os resultados obtidos com ensaios microcalorimétricos (20) e de antagonismo Ca2+
/H+
(21) apontam a presença de quatro centros de ligação independentes na calmodulina, com
valores de constantes de afinidade semelhantes para o cálcio.
Pelo contrário, a interpretação dos dados obtidos com estudos de ressonância magnética
nuclear (22) e de cinética rápida (23), suporta o modelo de dois pares de locais de ligação
orientados nas extremidades amina e carboxilo que apresentam relativamente ao cálcio valores
distintos de constantes de afinidade.
A calmodulina tem outros seis centros de ligação passíveis de serem ocupados por outro
ião que eventualmente module a ligação Ca2+
/calmodulina (24).
A ligação do ião à calmodulina induz nesta alterações conformacionais traduzidas pelo
aumento do conteúdo da estrutura , hé1ice e maior exposição à superfície de segmentos
hidrofóbicos, os quais constituem zonas de ligação a proteínas-alvo (5). Contudo, estas são
activadas pela calmodulina se, pelo menos, três centros de ligação estiverem ocupados pelo ião
cálcio (24).
A ligação entre o complexo Ca2+
calmodulina e as enzimas-alvo pode ser inibida por uma
variedade de compostos exógenos de natureza hidrofóbica (fenotiazinas (25),
naftalenosulfonamidas (26), antagonistas do cálcio (27) e macromoléculas endógenas (proteínas
de baixo peso molecular (28) e polipéptidos (29).
As proteínas-alvo que são activadas pela calmodulina não apresentam domínios
específicos comuns para a ligação; podem ser classificados com base nos locais de ligação
existentes na molécula de calmodulina que intervém no processo (30). Assim, existem três
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classes consoante são activadas (i) pelo fragmento C-terminal e pelo complexo CAPP-
calmodulina (calmodulina covalentemente ligada a um derivado de fenotiazina), (ii) pelo
complexo CAPP-calmodulina e interacção sem activação pela extremidade C-terminal, (iii) por
ligação a dois locais que não são os referidos (30).
A utilização de efectores em estudos experimentais contribui para o conhecimento do
mecanismo molecular de contracção muscular, em geral, e em particular da acção exercida pela
molécula de calmodulina.
Até à data, no que respeita aos túbulos T do músculo esquelético, não foi identificada
nenhuma proteína de características semelhantes à calmodulina em associação com o canal de
cálcio. Hidalge e colaboradores (31) isolaram e caracterizaram a partir de preparações de túbulos
T de músculo esquelético de coelho uma proteína que apresenta propriedades similares às
reveladas pela Ca2+
-Mg2+
-ATPase associada à bomba de cálcio, isto é, estimulada e inibida,
respectivamente, pela calmodulina e ortovanadato.
Meissner (32) e Plank e col (33) demonstraram in vitro que adições de calmodulina
exógena a preparações de vesículas da cisterna terminal do túbulo T regulam a libertação de
cálcio pelos canais de cálcio. Assim, Meissner (32) sugere que a repressão de saída de cálcio
exercida pela calmodulina impede a remoção total do ião do espaço mioplásmico durante a
actividade muscular prolongada.
No entanto não é controverso que a nível de cadeia leve de miosina (MLC)1
a
fosforilação que ocorre na zona designada por "cabeça", depende da presença do complexo Ca-
calmodulina (Ca-CaM) (Fig. 4). A ligação entre a cinase de cadeia leve da miosina (MLCK)1
(proteína-alvo) e o complexo Ca-CaM conduz ao aparecimento de alterações conformacionais
nas moléculas de calmodulina e de MLCK (34) e o grupo de Tokunaga (35) localizou
recentemente na molécula de miosina a disposição tridimensional dos locais de ligação para as
moléculas de actina e ATP e Ca-CaM.
FIGURA 4
Esquema da fosforilação da cadeia leve da molécula de miosina (MLC) (zona globular A) que
apresenta actividade hidrolítica (ATPasica) e é Ca2+
e calmodulina (CaM) dependente.
1 Siglas de nomenclatura anglo saxónica
SALDANHA C.
21
CARACTERIZAÇÃO DA ENZIMA Ca2+
ATPase NO RETÍCULO SARCOPLÁSMICO
A membrana do músculo esquelético dos túbulos transversos não contêm Ca2+
ATPase
dependente de calmodulina (36). No que respeita à membrana do retículo sarcoplásmico (RS), os
resultados dos estudos efectuados com inibidores de calmodulina sugerem que a fosforilação da
ATPase Ca2+
não é influenciada directamente pela calmodulina (5). A actividade cinase da
calsequestrina, estimulada pela calmodulina, está envolvida na regulação da Ca2+
ATPase (acção
indirecta da calmodulina) (37). A ATPase Ca2+
do RS pode existir nas formas mono (PM
110.000) e dimérica, prevalecendo a ocorrência de dímeros na presença de agente quelante do
ião cálcio (38). A estrutura proposta para a enzima é descrita por um modelo sequencial que
consiste em três domínios que correspondem, nomeadamente, aos locais de fosforilação, ligação
ao cálcio e zona transmembrana (39, 40). Este modelo permite explicar o "ciclo" de reacções que
ocorrem na translocação do ião cálcio do sarcoplasma para o lúmen por cada mole de ATP
hidrolisado, (Fig. 5).
Figura 5
Esquema em "ciclo" da reacção hidrolítica catalisada pela enzima Ca2+
ATPase (40; 41). A
ligação do ião Ca2+
à enzima (E), facilita a ocorrência de fosforilação pelo ATP da enzima (na
subcamada da membrana voltada para o citoplasma) (E1 P.Ca2+
). Subsequentemente a libertação
do ião cálcio no lúmen ocorre por conversão da enzima à forma E2 P.Ca2+
. Posteriormente há
hidrólise de fosfoenzima originando a forma E2 a que se segue isomerização para a forma E1.
No processo de transducção de energia, a enzima adopta dois estados conformacionais, El
e E2. O primeiro tem dois centros de alta afinidade para o ião cálcio, situados na face
citoplásmica da membrana do retículo sarcoplásmico, e o segundo apresenta dois locais de
menor afinidade situados no lúmen. A translocação do ião cálcio dos centros de maior para os de
menor afinidade ocorre em simultâneo com os processes de fosforilação e alteração
conformacional, que são acompanhados por movimentos estruturais no domínio de ligação ao
cálcio (rotação nas hé1ices) (42). A cedência do ião cálcio pela forma E2 é rápida e favorecida
pela presença dos iões amónio.
O proteolípido acídico, fosfolambano, existe na membrana do retículo sarcoplásmico em
igual proporção estequiométrica à da Ca2+
ATPase e é um efector da enzima (43). A forma
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fosforilada do fosfolambano induz alterações conformacionais na enzima, activa a hidrólise do
ATP e a translocação do ião cálcio a ela associado (44).
A diminuição de concentração do ião cálcio no sarcoplasma, resultante da acção da Ca2+
ATPase, induz a dissociação entre o ião e as moléculas de troponina C, ocasionando o
relaxamento. Assim, a energia na forma de ATP é necessária nos processos de contracção e
relaxamento muscular.
SUMMARY
Releasing of calcium ions from the sarcoplasmic reticulum after nervous stimulation initiates the
process of skeletal muscle contraction. Calcium ions bind to troponin C and conformational
alterations occur in the resulting complexes that are transmitted to tropomyosin and actin
molecules, leading to muscle contraction. Relaxation occurs after repolarization of the
sarcoplasmic reticulum membrane, and is accompanied by calcium influx, which is mediated by
the calcium pump (ATPase activity). Calmodulin is a calcium binding protein with great affinity
(kd 10-6
M) and specificity. It is involved in muscle contraction and relaxation respectively in a
direct and indirect way. The former process is related to myosin-action interaction, which is
facilitated by myosin light-chain phosphorilation in the presence of a calcium-dependent myosin
light chain protein kinase and calmodulin. Phosphorylation of myosin light chain (globular
extremity) induces conformational alterations on this "head", which favour its binding to actin.
The indirect action of calmodulin is manifested by calsequestrin (a protein of the inner
membrane of sarcoplasmic reticulum), which presents calmodulin dependent protein kinase
properties and is involve in the regulation of Ca2+
Mg2+ ATP enzymatic activity. The
conformational alterations in Ca2+
Mg2+
ATPase (occurring in the interconversion between the
two states of the enzyme) and in the proteins tropomyosin and actin proteins are related to the
biologic function of relaxation and muscle contraction.
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