aceite bromado

5/16/2018 Aceite Bromado - slidepdf.com

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INTRODUCCION

Los aceites vegetales bromados han sido ampliamente

utilizados como aditivos para alimentos y especificamente en 10

industria de refrescos como agentes ajustadores de densidad de

los aceites citricos saborizantes.

A pesar de que se ha permitido el usa de dichos compuestos

como aditivos para alimentos, existe una gran cantidad de

estudlosi-? que seAalan la toxicidad de los mismos. Como resultado

de estos reportes, el uso de los aceites bromados ha side prohibido

en algunos parses, y d6nde sf se permiten, solo es posible utilizorlos

hasta una concentraci6n maxima de 15 ppm 10. Por 1 0 que resulta

importante desarrollar un metoda cnolltlco para sucucntltlcoclon.

AI realizar un estudio blblloqrcfico sobre el tema se

encontraron reportados diversos rnetodosu-w. destacando 10

cromatografla de gases como una de las tecnlcos mas utilizadas.

Efectivamente, la cromatograffa de gases ha sido ampliamente



2

utilizada para el onollsls de los aceites vegetales bromados a pesar

de que las condiciones de trabajo necesarias para el desarrollo de

dicha tecnico provocan la descomposici6n de los aceites bajo

analisis21-23• Por otra parte, utilizando esta tecnlcc se dificulta el

oncllsls de los compuestos hexabromados a menos que se utilice

una columna copllorv.

La cromatografia de Ifquidos es 10 opclon mas viable para el

cncllsls de los compuestos que ocupan nuestro lnteres en este

estudlo. yo que con esta tecnlco deben eliminarse los problemas

de la descornposlclon del producto bajo onolisls y de la

determinacion de loscompuestos hexabromados.

Lawrence, Chadha y Conocher!' utilizaron un metoda de

cromatograffa de liquldos con detecclon UV a 220 nm para la

corocterlzoclon de aceites vegetales bromados, pero no

desarrollaron una metodologia para el onollsls de los mismos en

refrescos.

En este trabajo se desarrolla un rnetodo analitico para

cuantificar aceites vegetales bromados en refrescos, utilizando 10

tecnlco de cromatografia de Ifquidos de alta resoluci6n.



CAPITULO 1

A N T E C E D E N T E S

1.1 Naturaleza Qufmica de los Aceites Vegetales Bromados

Los aceites vegetales bromados (AV8) se obtienen

sometiendo los correspondientes aceites vegetales a una reocclon

de bromoclon. Los aceites vegetales mas utilizados para este

proposito son el aceite de moiz. el aceite de soya y el aceite de

olqodon: sin embargo. tornblen se encuentra reportado en la

literatura la bromoclon de otros aceites como por ejemplo los de:

ajonjolf, girasol, conolo. jojoba y aguacate24•

Dicha reacci6n se Ileva a cabo sobre la porclon insaturada

de 10 molecule de trlqllcerido que constituye el aceite vegetal y

que en la rncyorlo de los aceites proviene, principal mente, de los

ccldos oleico, linoleico y llnolenlco (figura 1). Por 10 tanto, sf se

somete un aceite vegetal bromado a una reocclon de

3



4

0

I ICH 2 0 C R

0

IICH 0 C R

0

I ICH 2 0 C R

R= Cadena Derivada de Acido Groso.

Figura 1. Moleculo de Triglicerido. Los Acidos, de Donee Proviene 1 0

Porclon Insaturada de la Mayoria de los Trigliceridos, son los

siguientes:

Acido Oleico: C H3 - (C H2)7 - C H = CH - (CH2)7 - CO O H

Acido Linoleico: C H3 -(C H2)4 -CH =CH -CH 2 -CH = C H -(C H 2}7 - e OO H

Acldo llnolenlco: C H3 - (C H2 - C H = CH }J - (CH 2}7 - CO O H



5

tronsesterlflcoclon con metanol se deben obtener. principalmente,

los siguientes derivados bromados: dibromoestearato de metilo

(OBEM), tetrabromoestearato de metilo (TBEM), y hexobromo-

estearato de metilo (HBEM).EI porcentaje obtenido de cada uno

de esos productos depender6, evidentemente, de la composlclon

qufmica del aceite vegetal de partida.

En la tabla I se reporta la composlcton qufrnlco de los

aceites de mafz y de soya. Se obtiene del onollsls de esa

informaci6n que 01 transesterificar el aceite bromado de mafz cabe

esperar 10 formaci6n de DBEM y TBEM;en el caso del aceite

bromado de soya, odemos de los productos anteriores, se debe

obtener el HBEM.

1.2Aptlccclon de los Aceites Vegetales Bromados

Los refrescos con sabores cftricos como los de naranja y

Iima-lim6n se encuentran entre los favoritos de los consumidores de

ese tipo de bebidas. Estos sabores eston constituidos

principalmente por los aceites esenciales obtenidos de algunas

trutos: por ejemplo, naranja, lim6n, toronja, etc. Sin embargo, 10

dispersion de estes aceites esenciales en el refresco constituye un

problema debido a la insolubilidad de los mismos en agua; eso



6

obliga a incorporar agentes emulsificantes en la formulaci6n de la

bebida. As! rnisrno. considerando que la habilidad de los agentes

emulsificantes para mantener el aceite en suspensi6n es

proporcional al tornofio de partlcula, las particulas de aceite son

reducidas por otomlzoclon,

TA B LA I

C O M P O SICI6N Q U iM ICA D E A CEITES VE G ETA LES

ACIDO % EN ACEITE DE MAiz % EN ACEITE DE SO Y A

Mirfstico < 0.1 < 0.5

Palmftico 8 - 19 7 - 14

Palmitoleico < 0.5 0.5

Estecrtco 0.5 - 4 1.4 - 5.5

Oleico 19 - 50 19 - 30

Linoleico 34 - 62 44 - 62

tlnolenlco < 2.0 4 - 11

Araqufdico < 1.0 < 1.0

Eicosenoico < 0.5 < 1.0

Docosanoico < 0 . 5 < 0 . 5

Tetracosa noico < 0 . 5 -

Por otra parte, no es suficiente lograr la emuIsi6n del aceite

en el refresco, sino que odemos esta debe ser estable 0 1 menos seis

meses. Un problema para conseguir dicha estabilidad es 10 baja

densidad de los aceites esenciales. En general. los aceites cftricos

tienen una gravedad especffica en el intervalo de 0.845 a 0.890



7

g/cm3 mientras que un refresco con un lOa un 12%de ozucor tiene

una gravedad especffica de 1.038 a 1.046 g/cm3• Para solucionar

este problema se utilizan los aditivos de peso, tornblen

denominados agentes ajustadores de densidad, y que son

compuestos que se ofioden a los aceites esenciales para

aumentar su gravedad especffica y ayudar a mantener una

dispersi6n estable del aceite. Unejemplo de este tipo de aditivos 10

constituyen los aceites vegetales bromados.

Losaceites vegetales bromados fueron utilizados por primera

vez, como agentes ajustadores de densidad de aceites esenciales

en bebidas en la decode de los ofios 40. Los aceites vegetales

bromados obtenidos a partir del aceite de oliva tienen una

gravedad especffica de alrededor de 1.24 g/cm3 y los obtenidos a

partir de aceites de soya, de rnofz0de algod6n. de alrededor de

1.33 g/cm3, Debido a su alta gravedad especltlco los AVB son

considerados como agentes ajustadores de densidad muy

efectivos para los aceites cftricos. Adernos proporcionan turbidez u

opacidad a los refrescos 10 cuol en algunos casos es una ventaja.

1.3 Regulacion de los Aceites Vegetales Bromados

Dependiendo de losaceites citrlcos utilizados. normalmente



8

se requieren de 120 a 160 ppm del AYB para lograr una emulsion

estable del aceite saborizante en el refresco. Sin embargo, en

1966, el Cornlte de Aditivos Para Alimentos de 10 Agrupacion

"World Health Organization" expresa su preocupoclon acerca de la

posibilidad de la ocurnuloclon de bromo en los tejidos del cuerpo

cuondo los AYB fueran utilizados en productos alimenticios de

consumo humano. Desafortunadamente, diversos estudios sobre los

efectos t6xicos de los AVB en animales de loborotorloi-s han

confirmado esa sospecha.

A pesar de que no existen pruebas sobre efecfos

pctoloqlcos especfficos en el ser humano, el uso de los AVB como

aditivos para alimentos tue prohibido en la India, Inglaterra y en

otros paises europeos. En algunos paises como Estados Unidos,

Canada, Australia, Espana, Finlandio, Noruega, Israel, Kenya y

Sudofrlco su uso fue limitado a 15ppm 10 en el refresco final.

1.4 Metodos de Analisis de Aceites Vegetales Bromados

Considerando 10 estricta regulaci6n a que eston sometidos

los AVB, se camprende 10 importancia de cantor con un rnetodo

analitico para su cucntlflcoclon. AI realizar una tnvestlqoclon

bibliogr6fica sabre el tema se encontraron reportados diversos



9

rnetodos de oncllsls de AVB, destacando las contribuciones del

grupo de trabajo de H.B.S.Conacher. A continuaci6n se describen

brevemente algunos de los estudios mas relevantes.

Deana L. Turner12 desarrollo un rnetodo para cuantificar AVB

en refrescos basado en la determinacion de bromo total en 10

muestra. Utilizando un procedimiento de debrornoclon en conjunto

can un electrodo especifico de ion brornuro. y trabajando a niveles

de 15 ppm del AVB, se reporta un 93% de recupercclon. una

precision de ± 1ppm y una exactitud de ± <1ppm.

Otro rnetodo. basado tornblen en la determinaci6n de

bromo total, es el que reportan M.S.Green y G. Keen13• Losautores

describen un metoda colorlmetrlco d6nde el bromo es liberado del

aceite utilizando dicromato de potasio y 6cido sulfurlco

concentrado; posteriormente, este se haee reaccionar con una

soluei6n de ocldo bcrblturlco-plrldlno en presencia de cianuro de

potasio para dar un color morado. De acuerdo a los autores los

resultados obtenidos en la determinacion de bromo en AVB

coinciden con los de otros rnetodos pero no proporcionan mas

detalles.

Losinvestigadores del Central Food Technological Research



10

Institute of Mysore14 desarrollaron una tecnlc« r6pida para detector

bojos niveles de AVB en refrescos. La prueba involucra 10

extracci6n del AVBdel refresco y su tratamiento con polvo de zinc

para convertir el bromo orqcnlco a su forma lnorqcnlco,

Posteriormente se trata la muestra con dloxldo de plomo, para

liberar bromo, que puede ser detectado por el cambia de color de

10 fluoresceina con la que es puesto en contacto. Sequn los

autores 10 prueba puede detectar hasta 1.5 ppm de AVB en

refrescos.

H.B.S. Conacher y Arthur D. McKenzie15 comparan tres

metodos de determinaci6n de bromo en AVB: 1) tltulcclon

vodornetrlco. 2) titulaci6n potenclornetrlco y 3) tltuloclon utilizando

electrodo especffico de bromuro. Ellos concluyen que tanto la

tltulcclon potenclornetrlco como la vodornetrlco son aceptables

para una determinacion precisa de bromo en AVB. Con la tercer

tecnlco reportan resultados mas bajos y variables.

Enla revision blblloqrotlco rea lizada se encontr6 que una de

las tecnicas mas empleadas para la cucntlflcoclon de AVB era la

cromatograffa de gases. H.B.S. Conacher, R.K. Chadha y M.R.

Sohosrobudhe!s se encuentran entre los primeros en reportar el usa



1 1

de esa tecnlco. EI procedimiento utilizado par elias involucra el

tratamiento de los aceites bromados con met6xido de sodlo.

seguido del onollsls par cromatograffa de gases de los esteres

metflicos resultantes. Empleando una columna empacada con 3%

JXRen Gas Chrom Q, de malla 110-120, Y como estondor interno

pentadecanoato de metilo logran recuperaciones en el intervalo

de 93.7 a 102.4%. Aplicando su tecnlco a varios refrescos

comerciales encontraron un contenido de AVB en el intervalo de

lOa 45 mg en 10 onzas de la bebida. Posteriormente H.B.S.

Conocher'" revlsc este rnetodo y reouzo un estudio colaborativo

sobre la determinacion por cromatograffa de gases de aceite

bromado de ajonjolf en bebidas de naranja. Los resultados del

estudio colaborativo seficlon recuperaciones de 94.6, 95.3 Y 96.0%

para refrescos conteniendo 3.1, 5.22 Y 10.66 mg/l 0 onzas de

bebida respectivamente, con los correspondientes valores de

desviaci6n est6ndar de 0.4, 0.46 Y 0.64. En base a este estudio se

desarroll6 el primer metoda oficial de 10 Asociaci6n Oficial de

QuTmicosAnalistas (AOAC).

James F. Lawrence, Rajinder K. Chadha y H.B.S.Conocher'e

modificaron el metoda previamente descrito proponiendo un

rnetodo alternativo de esterlflcoclon. Estos investigadores



12

transesterificaron los AVB mediante una metan61isis ocldo.

procedimiento que involucra reactivos mas tcclles de manejar que

los del metoda oficial. Adernos de la simplificaci6n del metoda. se

obtiene un cromatograma con picas simples para el DBEM.el TBEM

y el HBEM;por el contrario. con 1 0 tecnica del met6xido de sodio el

cromatograma obtenido es complejo, mostrando mezclas de picas

para el TBEMy el HBEM.

En los trabajos basados en 10 tecnlco de cramatografio de

gases que han side descritos, se utilizaron columnas de tipo

empacadas. Rajinder K. Chadha, James F. Lawrence y H.B.S.

Conochertv probaron una columna de tipo capilar, conservando el

procedimiento de transesterificaci6n via metanolisis ccldo

desarrollado por elias mismos. Su principal logro fue la detecci6n

del HBEM,analito que con las columnas empacadas era dificil de

detectar y no se obtenfan resultados reproducibles.

Tornblen se describe en la literatura un rnetodo que utiliza

espectrometrfa de fluorescencia de rayos-X para la detecclon y

estimaci6n semicuantitativa de AVB en refrescos. EI rnetodo fue

desarrollado par H.B.S.Conacher, J.C. Meranger y J. Leroux2o con el

abjetivo de contor can uno tecnica r6pida de an6lisis que pudiera



13

utilizarse de rnonero previa 0 1 onollsls por cromotograffa de gases y

asi facilitar el trabojo en el coso de tener un nurnero elevado de

muestras.

Finalmente se rnenclonoro la contribuci6n de James F.

Lawrence, Rajinder K.Chadha y H.B.S.Conocher!'. Ellosemplearon

un rnetodo de crornotoqroffo de liquldos en fase normal y en fase

reversa para la caracterizaci6n de aceites vegetales bromados. Su

principal objetivo fue 1 0 corocterlzocton de diferentes aceites

comerciales y preparados en el laboratorio. Ellos estudiaron los

aceites de oliva, cjonloli, rnoiz. olqodon y soya, y el procedimiento

que siguieron se describe brevemente a contlnuoclon.

La muestra de aceite es transesterificada mediante una

rnetcnollsls ocldo y el producto obtenido se extrae con hexane.

Despues de lIevar a sequedad la fase org6nica, el residuo se

disuelve en acetonitrilo- THFpara 10 cromatograffa en fase reversa y

en hexane para la cromatograffa en fase normal. Para 10 tecnlco

en fase reversa se utilize una columna Ultrasphere ODSde 25 cm x

4.6 mm, de 5 ) .1, Y una fase m6vil de acetonitrile-agua, 95:5. Para la

tecnlco en fase normal emplearon una columna Ultrasphere Si de

las mismasdimensiones que 10 anterior y una fase rnovll consistente



14

en hexano-isopropanol, 500:1. En ambos casos se utlllzo detecci6n

UVa 220 nm. Losautores utilizaron la relaci6n de TBEMa DBEMasi

como la presencia 0ausencia del HBEMpara identificar el aceite

invalucrado, reportando que sus resultados coinciden con los

obtenidos mediante la tecnico de cromatograffa de gases. No

aplicaron esta tecnlco al onollsls de refrescos.

De los rnetodos indicados, solamente los metodos

cromotoorotlcos son capaces de diferenciar e identificar los

diferenfes compuestos bromados individualmente 1 0 cuol

representa una ventaja. Sin embargo, la cromatograffa de gases

presenta algunos inconvenientes en 1 0 que respecta a 1 0

posibilidad de descornposlclon de los compuestos bajo onolisls:

diversos autores, como Landowne y Lipsky21,Koehler et al.22 y H.B.S.

Conocherw han encontrado evidencias de dicha descomposici6n.

Par otro parfe, se dificulta la detecci6n del HBEM,a menos que se

utilice una columna capilar. Par 1 0 tanto, la cromatograffa de

Ifquidos se convierte en una posibilidad mas interesante, que sin

embargo no ha side ampliamente explotada.

Asfsurge nuestro lnteres por el tema que se desarrollo en el

presente trabajo de investigaci6n y cuyos objetivos se describen a



15

continuaci6n.

1.5 Objetivos del Trabajo

1.5.1Objetivo General

Desarrollar un rnetodo onolltlco. utilizando la tecnica de

cromatograffa de Ifquidos de alta resoluclon (CLAR) para

cuantificar aceites vegetales bromados en refrescos.

1.5.2 Objetivos Especfficos

1.- Corccterlzoclon mediante una tecnlcc de cromatograffa

de Ifquidos de alta resoluci6n de los productos obtenidos en una

reacci6n de bromaci6n de un aceite vegetal. Para lograr este

objetivo, los aceites vegetales sercn fransesterificados, por 1 0 que

los productos a caracterizar seron los correspondientes esteres.

2.- Evaluaci6n de un sistema de extracci6n en fase solido

para la recupercclon de los esteres metilicos que son producto de

1 0 transesterificaci6n a 1 0 que seron sometidos los aceites vegetales

bromados.

3.- Evaluaci6n de un sistema de extracci6n en fase solido



16

para la recuperoclon del aceite vegetal bromado contenido en un

refresco.

4.- Aplicar el metoda de onollsls desarrollado, a algun

refresco de la localidad.



CAPITULO 2

M A T E R IA lE S Y M E T O D O S

2.1 Reactivos y Equipo

2.1.1 Reactivos

2.1.1.1 Solventes.

Se utilizaron eter etillco. hexane y metanal grado analftico

de Productos Qufmicos Monterrey. EI metanol fue secado con

sulfato de sodio anhidro (eTR). Para los onollsls cromotoqrotlcos

se utilizaron los siguientes solventes grado cromotoorcflco:

acetonitrilo (Mallinckrodt y fisher Scientific), THf (Merck) y agua

(Merck).

En diferentes eta pas del trabaja experimental se utlllzo un

solvente compuesto de acetonitrilo y THFen proporclon 4:1,el cucl

sera denominado "solvente A".

17



18

2.1.1.2 EsteresMetflicos.

Para ser utilizados como estondores en 10 carocterizaci6n de

los aceites vegetales, y para 10 preporcclon de los

correspondientes derivados bromados necesarios para el onollsls

de los AVB, fueron adquiridos de Aldrich los siguientes reactivos:

oleoto. linoleato, linolenato, estearato y palmitato de rnetllo. Para

la preparaci6n del est6ndor interno se adquiri6 de Sigma el

heptadecenoato de metilo.

2.1.1.3 Derivados Bromados de los Esteres Metflicos.

Los esteres metilicos fueron bromados de acuerdo al

procedimiento descrito a contlnucclon.

2.1.1.3.1 Oleato de Metilo. Se disolvieron 500 mg del oleato

de metilo en 15mL de eter etilico en un matraz de reacci6n de 25

mL y 10 soluci6n se IIev6 a O °C mediante 10 inmersi6n del matroz en

un bofio de agua-hielo-sal. Manteniendo dicha temperatura. y

bajo agitaci6n rnoqnettco constante, se dosificaron 0.15 mL de

bromo durante un perfodo de 20 minutos. Terminada la dosificaci6n

se mantuvo 10 agitaci6n a O °C par 10 minutas mas.

Posteriormente 10 soluci6n se transfiri6. anadiendo 15 mL

adicionales de eter. a un embudo de separaci6n que contenfa 50



19

ml de soluci6n de tiosulfato de sodio 01 10%.Seagito y despues se

permltlo 10 sepcroclon de capas para posteriormente descartar la

fase acuosa; la fase eterea por su parfe se love con dos porciones

de 10ml de agua y se seco con sulfato de sodio onhldro. EIeter se

elimin6 bajo corriente de nltroqeno a temperatura ambiente.

2.1.1.3.2 linoleafo, Linolenoto y Heptadecenoafo de

Mefilo. EIresto de los esteres metilicos fueron bromados siguiendo

el mismo procedimiento descrito, excepto que para el linoleato de

metilo se utilizaron 0.30 ml de bromo y para el linolenato de metilo

0.45 ml de dicho reactivo. En esta ultima reacci6n, 10 bromoci6n

del linolenato de rnetllo. se obtuvieron dos productos: uno soluble

en el medio de reocclon (denominado HBEMsoluble) y otro que

preclplto (denominado HBEMinsoluble).

2.1.1.4 Aceites Vegefa les y susDerivados Bromados.

los aceites vegetales de rnoiz y de soya utilizados en este

estudio fueron adquiridos en casas comerciales de la localidad. Sus

derivados bromados fueron preparados en el laboratorio siguiendo

el mismo procedimiento descrito para la bromaci6n de los esteres

metilicos pero utilizando 0.2y 0.3mLde bromo respectivamente.

Tcrnblen se utlllzc en este trabajo una muestra de un aceite



20

bromado comercial de la cornpofilo Haarmann & Reimer. Se trata

de un aceite bromado de rnoiz.

2.1.1.5 Soluclon ACida de Metana!.

Se disolvieron 2 mL de ccldo sulfurlco grado reactivo

(Desarrollo de Especialidades Qufmicas) en metonol y se otero 0

100mLcon metanol.

2.1.1.6 Refrescos.

Para el desarrollo del rnetodo de tratamiento de muestra se

utiliz6 un refresco de uva de 10 marco 10-K (producto importado).

Par atra parte, el rnetodo de onollsls propuesto en este trabajo se

probe en un refresco de toronja de 10 marco Joya (producto de 10

localidad). La cornposlclon de ambos refrescos se reporta en la

tabla II.

2.1 .2 Equipa

2.1.2.1 Sistema de Extraccion en FaseS6lida.

En dos eta pas del rnetodo de onollsls desarrollado en este

estudio se utlllzo un pracedimiento de extracci6n en fase s6lida. En

ambos casos se emplearon cartuchos empacados con 500 mg de

fase C-1B (Supelclean LC-18de Supelco) de 6 mL de capacidad. EI



21

sistema de extracci6n seleccionado fue el de presi6n positiva de

una linea de nltroqeno (figura 2); se utlllzo nitr6geno grado

crornotoqroflco (INFRA).

TABLA II

COMPOSICI6N DE LOS REFRESCOS EMPLEADOS

REFRESCO COMPOSICION

Refresco 1O-Ksabor uva Agua, ozucor. fructosa de jarabe de

rnoiz. ccloo cftrico, benzoato de

sodlo. sorbato de potasio, citrato de

sodio y de potoslo. sal, sabor natural.

fosfato de sodio y color caramelo.

Refresco Joya sabor toronja Agua carbonatada, czucor de cofio.

6cido cltrlco. saborizantes naturales y

artificia les. almid6n modificado.

aceite vegetal bromado y benzoate

de sodio.

2.1.2.2 Cromat6grafo de Llquidos de Alta Resoluci6n

(CLAR).

Se utllizo un crornotoproto de IIquidos modelo 5000 de

Varian equipado con un detector de arreglo de dlodos rnodelo

Polychrom 9065 (figura 3). Para el control del detector asf como

el manejo de la informacion resultante del onollsls crornotoqroflco

se utlllzo el software Star Chromatography version 4 de Varian

instalado en una computadora HPmodele Vectra VL2.



22

-+---- Nitr6geno

.:

......_-- Cartucho de Extrocclon

7l_ j

Figura 2. Sistema de Extrocclon en Fase S6lida.



23

Figura 3.Cromotooroto de Llquidos.



24

Se emple6 una columna de fase octadecil silano enlazada

(Supelcosil LC-18 de Supelco) con las siguientes caracterfsticas: 25

em de largo, 4.6 mm de dlcrnetro interno y torncno de partfcula de

5 urn. Tomblen se utlllzo una columna de guardia de 2 em de

longitud (Supelguard LC-18).

EIvolumen de lnvecclon fue de 10 JlLY 10 velocidad de flujo

de 1mL/min. Loseluentes utilizados fueron desgasificados utilizando

helio grado cromotoqroflco. (INFRA). Todas las muestras fueron

filtradas, previamente a su lnvecclon. can filtros de jeringa de 25

mm de dlcmetro y 0.45 urn de torncfio de poro (Iso-disc P-254 de

Supelco).

2.2 Corocterlzoclon por CLAR de los Esteres Metilicos

y de susOerivados Bromados

2.2.1 Introducci6n

Para 10 caracterizaci6n por CLAR de los AVB estos seron

sometidos a una reocclon de transesterificaci6n para liberar los

correspondientes esteres. es declr. los derivados bromados del

oleato y linoleato de metilo en el coso del aceite de moiz. y

odernos el del linolenoto de metilo en el caso del aceite de soya.



25

Por otra parte, se debe tomar en cuenta que si el aceite no

estuviera par completo bromado tornblen cabrfa esperar la

formaci6n de uno 0varios de los siguientes compuestos: olea to,

linoleato y linolenato de metilo. Adicionalmente, tornblen se deben

considerar los esteres provenientes de la porclon saturada del

aceite, que para los aceites estudiados son el palmitato y el

estearato de metilo.

Tomando en cuenta 10 anterior, si se pretende caracterizar

los AVB por CLAR,se debe desarrollar un metoda crornctoqrotlco

que permita 10 resoluclon de todos los onolitos indicados, incluido

el que sera utilizodo como estcndor interno, es decir, el

dibromoheptadecanoato de metilo (DBHM).

2.2.2 Desarrollo del Metodo Crornotoqroflco de Anollsls por CLAR

Se prepararon soluciones de los esteres metflicos y de sus

productos de bromaci6n en el solvente A (pp. 17).En 10 tabla III se

muestra la cornposlclon de cada una de las soluciones preparadas;

cabe seriolor que las concentraciones utilizadas se seleccionaron

de forma que 10 altura de todos los picas fuera semejante y asi

poder observarlos todos simultaneamente al analizar una mezcla

de los analitos.



26

Considerando que se debfan resolver 10 compuestos, y que

uno de ellos da dos picos (el TBEMLse tuvieron serias dificultades

en el desarrollo de un rnetodo cromotooroflco eficaz; sin embargo,

finalmente se lograron resultados aceptables con dos rnetodos que

seron Ilamados en este trabajo "metoda lsocrctlco" y "rnetodo

gradiente" y que a continuaci6n se describen.

TABLAIII

COMPOSICION DE LAS SOLUCIONES ANALIZADAS

ANALITO CONCENTRACION (mg/mL)

Oleato de metilo 0.94

Linoleato de metilo 0.20

Linolenato de metilo 0.1

Estearato de metilo 10.1

Palmitato de metilo 10.4

Heptadecenoato de metilo 10.0

DBEM 1.1

TBEM 2.54

DBHM 1.2

HBEMsoluble 8.30

HBEMinsoluble 2.86

1) Metodo lsocrotlco: En este rnetodo se utiliza como

eluente acetonitrilo. La longitud de onda de detecclon optima

para los analitos insaturados es de 195 nm y para los analitos

saturados es de 210 nm; en el caso de los analitos bromados es de



27

205 nm. Las soluciones indicadas en la tabla III y el solvente A,

fueron analizados siguiendo este metodo.

2) Metodo gradiente: En este rnetodo se utiliza como

eluente una mezcla de los solventes acetonitrile y agua. La

cornposlcion del eluente se modifica de acuerdo a un gradiente

por etapas, mismo que se describe a contlnuoclon,

En 10 primera etapa, 10 cual tiene una duroclon de 17

minutos, se trabaja con un 91% de acetonitrilo. Posteriormente se

cambia 10 cornposiclon del eluente a 100%acetonitrilo en dos

minutos y csi se mantiene el tiempo restonte de 1 0 corrldo

cromatogr6fica. Una vez terminado el onollsls. para preparar de

nuevo el sistema para 1 0 siguiente tnvecclon. se cambia 1 0

cornposlclon del eluente 0 91% de acetonitrilo en 5 minutos.

Las mismas soluciones que se onollzoron bojo el rnetooo

lsocrotlco. fueron onollzcdos bajo las condiciones de este rnetodo

gradiente.

2.3Eloboroclon de Curvas de Ccllbroclon

Considerando que el objetivo primordial de este estudio es

1 0 cuontttlcoclon de AVB, y que esta se reollzoro a troves de 1 0



28

cucntttlccclon de sus correspondientes esteres metflicos, es

necesario contar con curvas de calibraci6n para coda uno de

ellos. Por 10 tanto se procedi6 a la eloborcclon de curvas de

collbroclon para el DBEM,TBEM,HBEMsoluble y HBEMinsoluble.

Se preporo una soluci6n stock en el solvente A de los

analitos de lnteres: su composici6n se reporta en la tabla IV.

Adernos se preporo una soluci6n, en el mismo solvente, del

estoncor interno, con una concentroclon de 12.74 mg/mL.

TABLAIV

COMPOSICI6N DELASOLUCI6N STOCKDE

ESTERESMETiLiCOS BROMADOS

ANALITO CONCENTRACI6N (mg/mL)

DBEM 0.824

TBEM 1.13

HBEMsoluble 0.16

HBEMinsoluble 0.15

A partir de 10 soluci6n stock se hicieron 4 diluciones para

preparar las soluciones empleadas en 10 elaboroci6n de la curva

de conbroclon. A coda solucion se Ie agregaron 100 J.LLde 10

soluclon de DBHM. Las composlclon de las soluclones resultantes se

reparta en la tabla V.



29

Las 4 soluciones fueron analizadas par CLAR siguiendo los

dos rnetodos crornotoqroflcos desarrollados. Cada soluci6n se

invecta tres veces bajo las condiciones de cada uno de los

rnetodos,

TABLAV

COMPOSICION DE LAS SOLUCIONES UTILIZADAS PARA LA

ELABORACI6N DE LAS CURVAS DE CALIBRACION

SOL'N No. DBEM TBEM HBEMSOL HBEM INS. DBHM

(mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)

1 0.659 0.902 0.12 0.12 0.254

2 0.330 0.451 0.062 0.061 0.254

3 0.165 0.226 0.031 0.030 0.254

4 0.0824 0.113 0.016 0.015 0.254

2.4 Caracferizaci6n por CLAR de AVB

2.4.1 trcnsesterttlcoclon de los Aceites Vegetales y de sus

Derivados Bromados

Para transesferificar los aceites vegetales y sus derivados

bromados se seleccion6 el rnetodo de rnetcnotlsls ccldo

desarrollado por J. Lawrence, Rajinder K. y H.B.S.Conocher!s pero

modificado en 10 que concierne a 10 extracci6n de los esferes

metflicos 01 final de la reocclon.



30

En seguida se describen los procedimientos de transesterifi-

caci6n y de extracci6n utilizados

2.4.1.1 Procedimiento de Transesterificaci6n.

La muestra a transesterificar se coloco en un matraz de

reacci6n de 100 ml y se Ie agreg6 100 I I I de la soluci6n de DBHM

(est6ndar interno). EI solvente de la muestra y de la soluci6n del

est6ndar interno se ellmlno bajo corriente de nltroqeno.

Posteriormente se agregaron 25 ml de la soluclon 6cida de

metanol y se colento a reflujo (63°C) bajo agitaci6n rnoqnetlcc

constante. EIreflujo se rncntuvo por una hora al terrnlno de 10 cual

la mezela de reacci6n se enfrf6 y se Ie onodlo 40 ml de agua.

Cabe seriolcr que para evaluar este procedimiento de

transesterificaci6n se prepare una soluclon de aceite de soya en el

solvente A, Y fue analizada, sin transesterificar, utilizando el rnetodo

lsocrotlco, EI resultado obtenido se com para con el de una muestra

del mismo aceite que sf se sornetlo a este tratamiento de trans-

esterificaci6n

2.4. 1.2 Procedimiento de Extracci6n de los EsteresMetilicos.

Se utlllzo un procedimiento de extracci6n en fase solido. EI



31

cartucho se aeondicion6 con 3 ml de metanol seguidos per 5 ml

de agua a pH 3.

Despues del acondicionamiento se hizo pasar la mezcla de

reocclon por el cartucho a un flujo de 2.5 mL/min, y al finalizar

esta, se pasaren 5 mL de agua. Antes de proceder a 10 eluclon de

los analitos retenidos en el cartucho, este se seco con 1 0 ayuda del

flujo de nitrogeno.

Los esteres metflicos fueron elufdos con 10 mL de hexano,

utlllzcndose un flujo de 1 mL/min. EIhexane se seco eon sulfato de

sodio anhidro y despues de filtrarlo se eumlno bajo corriente de

nltroqeno y el residue se recupero con 3 mLde solvente A.

Para evaluar este procedimiento de extrocclon S9 preporo

una soluclon, en el solvente A, eon los derivados bromados

estondor. La cornposlclon de esa soluclon se reporta en 1 0 tabla VI.

Dicho soluclon se sornetto al proeedimiento de trcnsesterlflcoclon y

al de extrocclon previamente descrito, por triplicado. En cada

caso se utillzo una olfcuota de 1mL. La soluclon obtenida 0 1 final se

analiza por CLAR utilizando el metoda lsocrotlco. Para determinar

los porcentajes de recuperoclcn de los diferentes analitos, se

aprovecharon las curvas de collbroclon cuya elabaraci6n se



32

describi6 en la secci6n 2.3. Los resultados de esta evaluaci6n se

presentan en el capftulo 3.

TABLAVI

COMPOSICI6N DE LA SOLUCI6N UTILIZADA PARA LAEVALUACr6N

DEL PROCEDIMIENTO DE EXTRACCI6N

ANALITO CONCENTRACI6N (mg/mL)

DBEM 1.04

TBEM 1.78

HBEMsoluble 0.19

HBEMinsoluble 0.16

2.4.2 Ancllsls de los Aceites Vegetales y de sus Derivados

Bromados

Finalmenfe, una vez evaluados los procedimientos de

trcnsesterttlcoclon y de extracci6n descritos, can los est6ndares, se

procedi6 a trabajar con los aceites vegetales y sus derivados

bromados.

Uno de los objetivos de esta etapa era la caracferizaci6n de

los AVB Y para ella se trcbolo can el aceite de rnolz y can el de

soya y con sus respecfivos prod uctos de bromaci6n. EI aceite

bromado de Haarmann & Reimer tam bien se sornetlo a este



33

tratamiento de transesterificaci6n En cada caso se trabaj6 con 3

mg de muestra y la soluci6n obtenida, despues de la extracci6n de

los esteres rnetlllcos. fue analizada por CLAR utilizando el rnetodo

lsocrotlco 0el rnetodo gradiente, sequn fuera necesario.

Por otra parte, tornblen se evoluo la cornposlclon del aceite

de soya bromado ya que este fue utilizado para la evaluaci6n del

tratamiento de muestra. Para lograr este objetivo, se sornetio el

aceite al procedimiento de tronsesteritlcoclon descrito y 10soluclon

resultante se onollzo par CLAR utilizando el rnetodo lsocrotlco: los

analitos correspondientes fueron cuantificados. Esteprocedimiento

se hlzo por triplicado empleando en cada caso 3 mg de muestra.

2.5 Tratamiento de la Muestra

2.5.1 Introducci6n

Un punta muy importante en el desarrollo de un rnetodo de

an61isises el tratamiento de 10muestro. En este coso, los AVB que

se pretenden analizar se encuentran disperses en un refresco por 10

que es necesorio cantor con un rnetodo de extracci6n de los

mismos. EI rnetodo oficial de onollsls de los AVB utiliza una

extrocclon con eter etflico pero en este trabajo se propone un



34

procedimiento de extracci6n en fase salida.

Para la evoiuoclon de dicho procedimiento de extrocclon se

preporo. en primer lugar, una muestra de cornposlclon semejante a

la de un refresco y con una cantidad conocida de AVB.

Posteriormente se prob6 en dicha muestra el rnetodo de

extracci6n propuesto: el extracto obtenido fue transesterificado y

el producto cuantificado por CLAR para poder calcular el

porcentaje de recupercclon.

A contlnuoclon se describen brevemente las diferentes

eta pas mencionadas.

2.5.2 Preparaci6n de la muestra

Para lograr tener una matriz 10 mas semejante posible a la

de los refrescos que serfan analizados con el metodo propuesto, se

decidi6 utilizar, precisamente, un refresco que no contuviera AVB.

EIrefresco elegido fue uno de sabor uva de 10 marco 10-K.

Se decidi6 preparar la muestra con 15 ppm del AVB, que es

la concentraci6n maxima permitida para dlchos compuestos en un

refresco. Se selecclono el AVB de soya para esta evoluoclon

porque es el que contiene todos los analitos bromados de lnteres,



35

No fue facil la dispersion del aceite en el refresco y los

primeros intentos resultaron en porcentajes de recuperoclon muy

bajos. Sin embargo, resultaba aparente que el problema era la

deficiente dispersion del AVB y no el proeedimiento de extrocclon.

Despues de evaluar diversas maneras se encontr6 que el procedi-

miento de dispersion mas efectivo consistfa en utilizar una solucion

al 15%del solvente A en el refresco. Primero se disolvi6 el aceite

bromado en el solvente y luego se agrego el refreseo.

Procediendo de esa forma se evalu6 tcrnblen una muestra con

10%de solvente A.

2.5.3 Extraccion del AVBdel Refresco

Se utlllzo un procedimiento de extrocclon en fase salida. EI

cartucho se ocondlclono con 3 ml de metanol y 5 ml de agua.

Posteriormente se hicieron pasar 200 ml de la muestra de refresco

a trotor. rnezclodos con 100 III de la soluclon de DBHM,a un flujo

de 2.5 ml/min. Despues de poser la muestra el cartueho se tovo

con 5 mLde agua y se seco bajo el flujo de nltroqeno. EIcontenido

del cartucho fue elufdo con 10 ml de hexane (flujo de 1 mL/minj.

la soluclon obtenida se seco con sulfato de sodlo y despues de

filfrar se transfiri6 al matraz donde se efectuarfa la transesteri-



36

ficaci6n.

2.5.4 Transesterificaci6n y Recuperaci6n de los Esteres Metilicos

Para lIevar a cabo 1 0 trcnsesterltlcoclon se elirnino el hexano

de la soluci6n obtenido de la extracci6n previamente descrita. EI

residuo se sornetlo al procedimiento de transesterificaci6n descrito

en1 0seoclon 2.4.1.1 a partir del punto d6nde se ogrega

1 0soluclon

6cida de metanal. AI terrnlno de 10 reocclon de transesterificaci6n

los esteres metflicos obtenidos se recuperaron siguiendo el

procedimiento de extrocclon descrita en la secclon 2.4.1.2.

2.5.5 Anolisls por CLAR

Finalmente, 10 soluclon obtenida se analiza por CLAR

utilizando el metoda lsocrotlco.

Cabe senolor que tanto la muestra preparada con 10%de

solvente como la que se hizo con 15%fueron sometidas a todo este

tratamiento de muestra por duplicado.

2.6 Anctlsls de un Refresco

EI refresco seleccionado para ser analizado fue uno de



37

sabor toronja de 10 marco Joya cuya etiqueta de composlclon

indicaba la presencia de aceite vegetal bromado.

EIrefresco se sornetio 01 tratamiento de muestra descrito en

la secci6n 2.5 agregandole un 15%del solvente A. La muestra fue

analizada por triplicado. En cada caso el onollsls par CLAR se

reollzo por los dos rnetodos desarrollados.



CAPITULO 3

RES U LTA DO S Y D IS CU S IO N

3. 1 Caracterizoci6n per CLAR de los Esteres Metflicos

y de sus Derivados Bromados

3.1.1Anollsls Crornotoqroflco por el Metodo lsocrctico

3.1.1.1 Anollsls de los Esteres Metflicos.

En las figuras 4-8 (Apendlce A, pp. 70-74) se pueden observar

los cromatogramas obtenidos al analizar los esteres rnetlllcos bajo

las condiciones del rnetodo lsocrotlco. Por otro parte, en las figuras

9-13 [Apendlce B, pp. 91-95) 5e reportan los rnisrnoscromatogramas

pero en forma tridimensional para que se puedan apreciar los

diferentes picos a pesar de tener diferentes rncxlrnos de absorci6n.

Cabe seAalar que el pico de tiempo de retenci6n (tR) 3.2 minutos

que aparece en todos los cromatogramas corresponde al solvente

de las muestras como se confirm6 01 inyector este bajo las mismas

38



39

condiciones (el cromatograma correspondiente se encuentra en 1 0

figura 14,Apendlce A, pp. 75).

Con este trabajo quedaron establecidos los tiempos de

retenci6n de los analitos no bromados, as! como susespectros UV,

informacion que es necesaria para el onotlsls de sus derivados

bromados.

Observamos que el tiempo de retenclon se incrementa a

medida que disminuye el grado de insaturaci6n. En 1 0 que

concierne a 1 0 resoluclon de estos componentes, los resultados

obtenidos muestran que los unlcos picos que se traslaparfan son los

correspondientes 01 oleato y palmitato de metilo. No se hizo ningun

intento de resolverlos ya que dichos analitos,

no senan

cuantificados.

3.1.1.2 Anollsls de los EsteresMetflicos Bromados.

En 10 literatura se reportc= que al llevor a cabo la reooclon

de bromaci6n de aceites vegetales se forman slmultoneomente

productos de adici6n y de deshidrobromaci6n y par ella en este

trabajo era interesante determinar el nurnero de derivados

bromados formados 0 1 bromar los esteres metilicos. Par supuesto

que esto queda sujeto a que dichos derivados sean detectables



40

mediante el oncllsls cromotoqrcflco utilizado. En las figuras 15-18

(Apendlce A, pp. 76-79) se presentan los cromatogramas,

obtenidos bajo las condiciones del metoda isocrotlco. para coda

producto bramado. Parotro parte, en las figuras 19-22 (Aperidlce B.

pp. 96-99) se reportan los mismos cromatogramas pero en forma

tridimensional para que se aprecien los diferentes picas a pesar de

tener diferentes m6ximos de absorci6n.

A continuaci6n se describen los resultados obtenidos para

coda uno de los productos de bromaci6n.

3.1.1.2.1 Oleato de Metilo Bromado. AI comparar las figuras

4 y 15 (Apenclce A. pp. 70 Y 76) observamos los diferentes tiempos

de retenclon obtenidos, en un caso para el oleato de metilo, y en

otro para su producto bromado y en la figura 23 (Aperidlce C. pp.

102) se aprecia la diferencia en susespectros UV;con ambos datos

se confirma que 10 bromoclon se neve a cabo. Por otra parte, la

ausencia de un pico a 11.3 minutos en el cromatograma del oleato

de metilo bromodo nos indica que 1 0 brornoclon fue completo.

En 10 que concierne al nurnero de productos obtenidos al

bromar el oleoto de metilo observamos en el cromatograma

correspondiente un pica principal de tiempo de retenclon de 9.7



41

minutos; ese pica debe corresponder al dibromoestearato de

metilo que es el producto principal esperado en la reacci6n

efectuada. Se observa oderncs un pico de muy poco intensidad

con un tiempo de retenci6n de 8 minutos y un espectro UV

diferente 0 1 del pico principal como se puede apreciar en 1 0 figura

24 (Apendlce C, pp. 103). No se determin6 a que compuesto

corresponde, sin embargo, es poco probable que pertenezca a un

derivado bromado sin dobles enlaces C-C ya que como se vera

mas adelante dichos compuestos tienen espectros muy similares

entre elias.

Cabe agregar que se determine pureza de pica en cada

coso, y en base a los Indices de correlaci6n encontrados (tabla

VII), se determine que coda uno corresponde a un solo

componente.

TABLA VII

PUREZADE PICO EN El CROMATOGRAMA

DEL OlEATO DE METIlO BROMADO

PICO MEJOR CORRElACI6N PEOR CORRELACION

B.Omin 0.999492 0.9940629.7 min 0.999997 0.999985



42

3.1.1.2.2 Linoleato de Metilo Bromado. Enel cromatograma

correspondiente a este producto (figura 16. Apenclce AI pp. 77)

observamos dos picas principales; a pesar de que el tiempo de

retenci6n del segundo es similar al del linoleato de metilo (figura 5,

Apendlce A, pp. 71) podemos afirmar que 10bromaci6n si se llevo

o cabo considerando las diferencias entre los respectivas espectros

UV (figura 25, Apendlce C, pp. 104).

Por ofra parte se confirma que la brornoclon es completo al

determinar la pureza del pico de tiempo de retenci6n de 7.9

minutos. Tomblen se analiza la pureza del pico de tiempo de

retenci6n de 7.5 minutos. En ambos casas se concluye que

corresponden a un solo componente, como 10 seAalan los fndices

de correlaci6n reportados en la tabla VIII.

TABLA VIII

PUREZA DE PICO EN EL CROMATOGRAMA

DEL LlNOLENATO DE METllO BROMADO

PICO MEJOR CORRELACI6N PEOR CORRELACI6N

7.5min 0.999996 0.999975

7.9min 0.999983 0.999878

En 1 0 que respecta al nurnero de productos obtenidos yo se



43

ha sefiolcdo la obtenci6n de dos componentes principales, los

cuales pueden correponder ados is6meros del tetrabromo-

estearato de metilo, como se reporta en la llterofurcu. Sin

embargo no se confirm6 la identidad de dichos compuestos por

algun otro metoda.

Adernos de los dos picos principales indicados, se presentan

en el cromatograma una serie de picos, de muy baja intensidad, a

5.6, 6.0, 6.4 y 10.7 minutos que no parecen corresponder a

derivados bromados sin insaturaciones C-C analizando sus

espectros UV (figura 26, Apendlce C, pp. 105).

3.1.1.2.3 Linolenato de Metilo Bromado. Como ya se habra

mencionado en el capftulo anterior, al bromar el linolenato de

metilo se obtienen dos productos can diferente solubilidad en el

medio de reacci6n (denominados H B E M soluble y H B E M insoluble).

Ambos fueron analizados par separado.

AI comparar los cromatogramas del linolenato de metilo y

de susderivados bromados (figuras 6, 17Y 18,Apendlce A, pp.72J8

Y 79), se observa una gran similitud entre susrespectivos tiempos de

retenci6n. Sinembargo, 0 1 igual que en los casos anteriores, son las

diferencias entre el espectro UV del material de partida y los



44

espectros UV de los derivados (figura 27, Apendlce C. pp. 106) 10

que nos permite afirmar que sf se Ilevo a cabo la reocclon de

bromaci6n.

Para verificar que 10 bromaci6n fue completa se determino

pureza de pico del unlco pica del HBEM insoluble y del pico

principal del HBEMsoluble; considerando los fndices de correlaci6n

encontrados (tabla IX ) se concluye que ambos picos corresponden

a un solo componente y por 10 tanto que la bromaci6n fue

completa.

TABLAIX

PU REZA DE PICO EN LOS CRO M A TOG RA M A S

DEL HBEM SOLU BLE Y DEL HBEM IN SO LU BLE

MEJORCORRELACI6N,

Pice PEORCORRELACION

HBEMins., 6.2 min 0.999993 0.999828

HBEM sol.. 6.4 min 0.999966 0.999918

Como puede observarse en el cromatograma del HBEM

insoluble. dicho producto solo consta de un componente. En

cambia, en el caso del HBEMsoluble se obtiene un pico principal y

tres de menor intensidad. Tanto el pica principal como los picos de

tiempos de retenci6n de 6.2 y 7.0 minutos presentan espectros UV



45

muy similares entre elias (figura 28, Apendlce C, pp. 107) Y con

respecto a los de los derivados bromados de los otros esteres: ello

hace suponer que se trata de tres productos bromados sin

insaturaciones C-C, al igual que el HBEM insoluble. EI pico de

tiempo de retenci6n de 8.0 minutos presenta un espectro UV

diferente.

En base a 10 anterior se tendrfan 4 productos principales

derivados de la bromaci6n del linolenato de metilo. Lawrence,

Chadha y Conucher!'. solo reportan la obtenclon de dos lsorneros.

de diferente solubilidad, coincidiendo con este trabajo en que el

is6mero mas insoluble eluye primero en el sistema crornotoqrotlco.

3.1.1.3 Anollsls del Est6ndar Interno.

En las figuras 29 y 30 (Apendlce A, pp. 80 Y 81) se reportan

los cromatogramas obtenidos, bajo las condiciones del rnetodo

lsocrctlco. para el heptadecenoato de metilo y para su derivado

bromado (DBHM) respectivamente. AI comparar los tiempos de

retenci6n de ambos productos y susrespectivos espectros UV (figu-

ra 31, Apendlce C, pp. 108) se confirm a que la brornoclon se llevo

a cabo. Por otra parte 10 ausencia del pico de tiempo de

retenci6n de 9.2 minutos en el cromatograma del producto



46

bromado indica que 10 brorncclon fue completa.

En la figura 32 (Apendlce B, pp.100) se reporta el croma-

tograma del DBHM de forma tridimensional y ahf se puede

comprobar que solo se obtiene un pico. Adernos. el onollsls de

pureza de pico del mismo nos indica que se trata de un solo

componente (mejor correlaci6n = 0.999968, peor correlcclcn =

0.998945).

3.1 .1.4 Ancllsls de Mezcla de Analitos.

En la tabla X se resumen los tiempos de retenclon y los

factores de capacidad que se obtuvieron, bajo las condiciones del

metodo lsocrotlco, para todos los analitos estudiados. Cabe hacer

10 ocloroclon que en el caso del TBEM se consideraron los dos picos

principales y en el caso del HBEM soluble solo se consider6 el pica

principal.

Por otra parte, para el c61culo del factor de capacidad se

consider6 un tiempo muerto (to) de 3.2 minutos; este tiempo

corresponde al obtenido para el solvente de 10 muestra y fue

corroborado mediante 10 lnvecclon de una soluci6n de uracil,

siendo este compuesto un trazador recomendado en la literatura

sabre el terno>.



47

TABLAX

TIEMPOSDERETENCIONY FACTORESDECAPACIDAD DELOS

ANALITOSBAJO ESTUDIO(METODO ISOCRATICO)

ANALITO TIEMPO DE FACTOR DE

RETENCION (min) CAPACIDADt

Oleata de metilo 11.4 2 . 5

Linoleato de metilo 8.2 1.6

Unolenato de metilo6.4 1.0Palmitato de metilo 11.6 2.6

Estearato de metilo 17.2 4.4

DBEM 9.7 2.0

TBEM (l0 pieo) 7.5 1.3

TBEM(20 plco) 7 . 9 1.5

HBEMsol. 6.4 1.0

HBEMins. 6.2 0.9

DBHM 8.1 1.5

t Factor de capacidad = ( tR- t o ) / to

Del onolisls de la informacion presentada en la tabla X se

puede predecir que se tendron problemas de resoluci6n, par una

parte, entre los picas del DBHM, del linoleato de metilo y del TBEM,

y por otra, entre los picas del linolenato de mettle y sus derivados

bromadost . Para corroborar 10 anterior se inyect6 una mezela de

todos los analitos, utilizando las condiciones del metoda lsocrctlco,

EIeromotograma resultante se muestra en 10 figura 33 (Apendlce A,

tTorncien sefrostopcnon lospices del oleate y del palmitato de metilo pere, como ya

se habra seiialado, dichos analites no seron cuantificados y por eso no es necesaria

sucomplete resoluci6n.



48

pp. 82) confirm6ndose las predicciones. Como se observa, si la

muestra a analizar est6 por completo bromada no se tendrfan

problemas con el usode este rnetodo crornotoqroflco: incluso, si la

muestra contiene restos de compuestos insaturados sin bromar, oun

es posible utilizar el rnetodo lsocrotlco siempre y cuando se utilice

como longitud de onda de detecci6n 220 nm y se este dispuesto a

perder sensibilidad. En efecto. 0 dicha longitud de onda los

compuestos insaturados disminuyen su absorci6n en mayor grado

que los derivados bromados como puede comprobarse 0 1 analizar

la figura 34 (Apendlce C, pp. 109);en dicha figura se comparan los

espectros UV de un compuesto insaturado y de un derivado

bromado. Par otra parte en 10 figura 35 [Apendlce A, pp. 83) se

reporto el cromatograma de la mezela de analitos 0 una longitud

de onda de 220 nm.

3.1.2 Analisis Crornotoqroflco por el Metoda Gradiente

Para lograr la resoluci6n de todos los analitos se utiliz6 como

eluente una mezela de agua y acetonitrilo. Despues de probar

diversas composiciones de fose m6vil se IIeg6 a la conclusi6n de

que eon un 9% de agua se lograbon los mejores resultados. Es

decir. se obtenfon los picos de linolenato de metilo. HBEMsoluble.



49

HBEMinsoluble y linoleato de metilo completamente resueltos y

parcialmente resueltos los picas del TBEMy del DBHM.

EI siguiente paso fue intentar un gradiente para tratar de

mejorar la resoluci6n de los picas del TBEMy del DBHM, y disminuir

los tiempos de retenclon de los diferentes analitos. Los mejores

resultados se obtuvieron can el metoda descrito en el capftulo 2 y

que fue denominado "metodo gradiente". Aunque no se loqro una

completa resoluci6n de los picas mencionados. esto mejor6,

pasando de un valor de 0.9 a 1.2 entre el primer pico del TBEMy el

pica del DBHM; el segundo pica del TBEMse obtiene como pica

cola del DBHMen todos los casos.

En las figura 36-45 [Apendlce D. pp. 111-120)se reportan los

cromatogramas obtenidos bajo las condiciones de este metoda

cromatogr6fica para coda uno de los analitos estudiados y en la

tabla XI se resumen los tiempos de retenci6n y los factores de

capacidad de todos elias. EI cromatograma obtenido para 10

mezcla de analitos bajo estas condiciones cromatogr6ficas se

puede apreciar en 10 figura 46 (Apendlce D, pp.121). En base a

estos resultados se concluye que si el aceite no esto par completa

bromado es preferible utilizar este metoda crornotoqrotlco.



50

En 10 que respecte ol tiempo de onollsls este se logro ocortor

can el rnetodo desarrollado. como puede observarse en la figura

47 [Apenoice 0, pp.122). En dicha figure se comparan 105

cromatogramas obtenidos para el DBEM bajo las siguientes

condiciones: elucton lsocrotlco con el eluente acetonitrilo:eguo,

91:9, y eluci6n bajo las condiciones del metodo gradiente; se

puede observar que odernos de lograr tiempos de onollsls mas

cortos se logran picas mas angostos 10 que repercutlro en una

mayor sensibilidad.

TA B LA X I

TIEM PO S D E R ETEN CIO N Y FA CTO RES D E CA PA CID A D D E LO S

A N A LITO S B A JO ES TU D IO (M ETO D O G R A D IEN TE )

ANALITO TIEMPO DE FACTORDE

RETENCION(min) CAPACfDAD

Oleato de metilo 26.6 7 . 3

Linoleato de metilo 19.1 5.0

Linolenato de metilo 12.5 2.9

Palmitato de metilo 26.8 7 . 4

Estearato de metilo 31.8 8.9

D B E M 2 4 . 7 6 . 7

TBEM{l0 pico] 19.5 5.1

TBEM1 2 0 pico) 20.6 5.4

HBEMsol. 15.9 4.0

HBEMins. 1 5 . 0 3.7

D B H M 20.4 5 . 4



51

3.2Hoboroclon de Curvas de Calibraci6n

Para cuantificar los analitos de interes se utlllzo un rnetodo

de estondor interno y se trabaj6 en base a las alturas de pico. En

las figuras 48-51 (Apendlce E,pp. 129-132)se reportan las curvas de

calibraci6n, promedio de tres replicas, para cada uno de los

analitos que se cuantificaron, par el rnetodo lsocrctlco: por otra

parte, en las figuras 52-55 (Apendloe E,pp. 132-136) se muestran las

curvas correspondientes para el metoda grodiente. Cabe aclorar

que los dos compuestos de HBEMobtenidos se cuantificaron par

separado y que en el coso del TBEMse sumaron las alturas de los

dos picos obtenidos.

Encada figura se muestra, odernos. 10 linea de reqreslon de

y en x obtenida y el cuadrado del coeficiente de correlaci6n

resultante. Asl mismo se reporta en cada grafica 10 ecuoci6n de la

linea de regresi6n.

Como puede observarse, los valores de correlaci6n

obtenidos nos indican que 10 respuesta de nuestro sistema

crornotoqrotlco es lineal en el intervalo de concentraciones

evaluado para cada anolito, mismo que se reporta en la tabla XII.

Endicha tabla tornblen se incluyen los intervalos de concentroclon



52

esperados para cada analito; esos valores se calcularon

considerando que 10 concentraci6n del aceite bromado en el

refresco sea de 15 ppm y tomando en cuenta la composici6n

tiplco de los aceites de rnolz y de soya (tabla I, pp. 6).

TA B LA X II

IN TERVA LO D E CO N CEN TRA C IO N EVA LU A D O

Y E SPER A D O PA R A C A D A A N A LITO

ANALITO INTERVAlO DEConc. INTERVALODEConc.

EVAlUADO (mg/ml) E S P E R AD O (mg/mL)

H B E M Soluble 0.016 - 0.12 0.03 - 0.08

H B E M Insoluble 0.015 - 0.12 0.03 - 0.08

T B E M 0.113 - 0.902 0.4 - 0.7

D B E M 0.0824 - 0.659 0.1 - 0.5

En las figura 56 (Apendlce A, pp. 84) y en la figura 57

(Apendlce D, pp. 123) se muestran cromatogramas tlplcos

obtenidos en cada rnetodo crornotoqroflco.

3.3 Caracferizaci6n par CLAR de AVB

3.3. 1 Tronsesterlflcoclon de Aceites Vegetales y de sus Derivados

Bromadas

AI comparar en 10 figura 58 [Apendlce A t pp. 85) los croma-



53

togramas obtenidos para el aceife de soya antes y despues de ser

transesterificado confirmamos que 10 reacci6n se llevo a cabo;

efectivamente, observomos 10 desoporiclon de los picas

correspondientes al aceite y la aporici6n de los picas relacionados

can susderivados metflicos.

Par otro parte, en 10 que concierne a la evaluaci6n del

procedimiento de extracci6n se obtuvieron los siguientes

resultados. En la tabla XIII se reportan el porcentaje de

recuperaci6n promedio de cada analito osl como el coeficiente

de variaci6n en porciento (% C.V.) correspondiente. Observamos

que los porcentajes de recuperaci6n son buenos aunque podrfan

mejorarse y que el coeficiente de variaci6n se encuentra dentro

del valor esperado tomando en cuenta el nivel de concentraci6n

que se esto manejando para los analitos.

TABLAXIII

RESULTADOSDELAEVALUACI6N DELPROCEDIMIENTODE

EXTRACCIONPOSTERIORA LATRANSESTERIFICACION

ANA LITO % DE RECUPERACI6N % C.V. t

DBEM 85.4 3.8

TBEM 86.5 13.5HBEMSoluble 78 18.6

HBEMInsoluble 82 7.4

1% C.V. = (Desvlcclon Estondor x 100) / Valor Promedio



54

3.3.2 Anollsls de los Aceites Vegetales y de sus Derivados

Bromados

AI analizar los cromatogromas correspondientes 0los aceites

vegetales de soya y de rnclz transesterificados (figuras 59 y 60,

Apendlce A, pp. 86 Y 87) se pueden identificar, por sus tiempos de

retenci6n y susespectros UV, los componentes esperados: oleato,

linoleato y linolenato de metilo. En reolidad no se esperaba

detectar el linolenato de metilo en el coso del aceite de moiz ya

que su porcentaje en el mismo suele ser muy bajo; sin embargo se

puede observar en el cromatograma correspondiente un pico que

coincide tanto en tiempo de retenci6n como en espectro UV con

el del linolenato de metilo.

En 1 0 que respecto a los componentes saturados, es decir,

palmitato y esteorato de metilo, estos no fueron detectodos tal vez

debido a su bajo factor de respuesta.

En el cramatograma del aceite de rnclz bromado y

transesterificado (figuro 61, Apendlce D, pp. 124) se pueden

identificar los picos correspondientes 0 1 TBEMY 0 1 DBEM; no se

observon los picas del HBEM debido posiblemente 0 10 baja

concentraci6n del linolenoto de metilo en el aceite de rnolz



55

original. Por otra parte, 10 ausencia de los picas del oleato y del

linoleato de metilo nos indica que la bromaci6n fue completa.

En 10 que concierne al aceite de soya bromado se pudieron

identificar, en su producto transesterificado, los picos correspon-

dientes al HBEM,TBEMY DBEM(figura 62, Apendlce D, pp. 125); al

igual que en el coso anterior la ausencia de los picos de linolenato,

linoleato y oleato de metilo serialan que 1 0 bromaci6n fue

completa.

La composici6n del aceite de soya fue evaluada y los resultados

obtenidos se reportan en la tabla XIV; se indica el porcentaje

promedio de cada analito as! como el coeficiente de variaci6n en

porciento correspondiente en coda caso. Losvalores encontrados

dependen de 10 composici6n del aceite de partida 10 cuol no tue

determinada; sin embargo, a partir de datos de cornposlclon tipica

reportados en la literatura (tabla I, pp. 6), se pueden estimar de

monero oproximada los valores esperados para los componentes

bromados. Procediendo de esa forma, se observan resultados

dentro del intervalo esperado para el HBEMy un poco mas bajos

para el DBEMy TBEM.En 10 figuro 63 (Apendlce A, pp. 88) se puede

observar un cromatograma tipico de este onollsls.



56

TABLA XIV

COMPOSICI6N DEL ACEITE DE SOYA BROMADO

ANALITO % PROMEDIO %C.V.

H B E M insoluble 3.07 4.98

H BEM soluble 5.78 4.70

T B E M 38.5 7.88

D B E M 12.6 11.28

Finolmente, en cuonto 0 1 onollsls del aceite bromodo

camercial se obtuvieron los siguientes resultados. Como puede

observarse en la figura 64 [Apendice D. pp. 126) se pudieron

detector los picas correspondientes a los derivados bromados,

DBEMY T B E M , asi como los picas de los esteres metflicos sin bromar

carrespondientes. es decir, oleato de metilo y linoleato de metilo.

No se pudo detector 10 presencia del segundo componente del

T B E M . debido posiblemente a su baja concentraci6n.

Por otro parte. se detectan dos picos que no pudieron ser

identificados (tiempos de retenci6n de 18.2 y 18.7minutos) y cuyos

espectros UV no corresponden a los clcslcos de los componentes

bromodos sin lnsaturociones C-C. Iomblen se incluye en el crorno-

tograma el pico del est6ndar interno, DBHM.



57

3.4 Tratamiento de lo Muestra

En 10 tabla X V se reportan los resultados obtenidos para los

dos tipos de muestras preparadas. En dicha tabla se indican tanto

los porcentajes de recupercclon (% de Rec.) promedio obtenidos

para cada uno de los analitos, as! como los correspondientes

coeficientes de vorlcclon en porciento. Observamos que a mayor

porcentaje de solvente mejora el porcentaje de recuperocion: sin

embargo, aparentemente disminuye la precision como se refleja

en los coeficientes de vorlcclon. Suponemos que 10 mejora en los

poreentajes de recuperoclon se debe a una mejor dispersi6n del

aceite en el refresco pero no nos explicamos el aumento en 10

dispersion de los resultados obtenidos.

TABLA XV

RESULTADOS DELA EVALUACI6N DEL PROCEDIMIENTODETRATAMIENTODEMUESTRA

ANALITO MUESTRA10%SOLVENTE MUESTRA15%SOLVENTE

% de Ree. %C.V. % de Ree. %C.V.

HBEMins. 67.0 B .8 80.5 2.4

HBEMsol. 70.0 1.1 79.2 3.9

T B E M 73.9 6.1 79.6 12.0

DBEM 72.7 5.9 73.5 15.3



58

En 10 figur~ 65 (Apendlce A. pp. 89) se reporta un

cromatograma tiplco obtenido en esta etopa del trabajo

experimental. d6nde se observan los picas correspondientes a los

analitos bromados bajo estudio.

3.5 Anollsls de un Refresco

En la figura 66 (Apendice D. pp. 127) se reporta un

cromatograma tipico obtenido al analizar un refresco bajo las con-

diciones del rnetodo gradiente. Endicho cromatograma se pueden

identificar los picos correspondientes a los siguientes derivados

bromadas: TBEM(el primer pico) y DBEM.As!mismo. se detectan los

picas de los compuestos sin bromar: oleato, linoleato y linolenato

de metilo. Losdos picos de tiempos de retenci6n de 18.3 min y 18.8

min son semejantes a los obtenidos en el anal isis del aceite

bromado comercial, tanto en tiempo de retenci6n como en

espectro UV.

En el refresco se cuantificaron los analitos DBEMy TBEM;los

resultados correspondientes se reportan en 10 tabla XVI. Sa indica

10 concentraci6n promedio obtenida para coda onollto asi como

el correspondiente coeficiente de voriaci6n en porciento.



59

TA BLA X VI

RESU LTA D O S D E LA EVA LU A C I6N D EL REFRESCO

ANALITO CONC. (ppm) % C. V.

DBEM 1.5 12.4

T B E M 3.1 13.0

EI coeficiente de vorloclon obtenido en cada caso se en-

cuentra dentro de los Ifmitesesperados considerando las concen-

traciones que semanejan. A partir de los datos encontrados no es

posible calcular el contenido de aceite puesto que para ello se

debe conocer 10 cornposlclon del aceite utilizado.

Con el an6lisis de este refresco se demuestra la posibilidad

de aplicaci6n del rnetodo desarrollado para el onollsls de muestras

reales.



CAPITULO 4

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Se cumpli6 el objetivo general de este trabajo de

investigaci6n, es decir, se logr6 desarrollar un metoda analftico,

utilizando 10 tecnica de cromatograffa de Ifquidos de alta

resoluci6n (CLAR). para cuantificar aceites vegetales bromados en

refrescos. Por su parte. en 1 0 que concierne a los objetivos

especfficos, se tienen las siguientes conclusiones y recomen-

daciones.

Sedemostr6 que es posible la caracterizaci6n de los esteres

metflicos y de sus derivados bromados utilizando la tecnlco de

cromatografla de Ifquidos de alta resoluclon. reportondoso dos

rnetodos de onotlsls para lograrlo. As! mismo, en base al metoda

crornotoqrcflco desarrollado can los est6ndares se lagro la

coroctertzoclon de los derivados metilicos del aceite vegetal

bromada y sin bramar. Cabe seAalar que al utilizar el denominado

60



61

rnetodo gradiente se recomienda que la composici6n del eluente

sea 1 0 mas exacta posible ya que la resoluclon de los picos es muy

sensible a pequenos cambios en 10 composici6n empleada.

En el estudio de los aceites vegetales bromados es

interesante el onctlsls de los diversos productos obtenidos en lo

reacci6n de bromaci6n, sequn 10 destacan algunos investi-

gadores24• Can relaci6n a ese punto, la contribuci6n de este

trabajo es la siguiente: se determine que de forma principal se

forman los productos correspondientes a la reocclon de adici6n:

DBEM,TBEMY HBEMpero que no puede descartarse la posibilidad

de formaci6n de productos de deshldrobrornoclon. ya que, sabre

todo en el cromatograma del HBEM, se detectan una serie de

picos de baja intensidad. Para esclarecer este punta se debe

recurrir a una cromatografia preparativa que permita separar los

diversos componentes detectados y asf poder proceder a su

caracterizaci6n por tecnlcos espectroscoplcos,

En 1 0 que respecta al estondor interno utilizado cabe senolor

que fue un acierto la elecclon de un producto bromado en lugar

del sugerido en la literatura sabre el tema. Efectivamente,

normalmente habfa sido empleado el pentadecanoato de metllo,



62

el cuol no se cornportorc. frente a una extrocclon. de manero tan

similar a los analitos bromados como nuestro estondor bromado.

Aunque, por otra parte, debido precisamente a la similitud del

mismo can los analitos bajo estudio no se loqro la completa

resoluclon del mismo. Eneste estudio no fue posible 10 evoluoclon

de otro compuesto como estondor interno pero es recomendable,

si se desea mejorar 10 precision del rnetodo desarrollado, trabajar

preferentemente con un estcndor completamente resuelto; para

ello se sugiere probar preparando el derivado bromado del ester

metflico del ocldo nonadecenoico 0del ocldo eicosenoico.

Un resultado importante de este trabajo fue el obtenido 01

elaborar las curvas de collbroclon. Las mismos indican que la

respuesta del sistema crornotoorcttco es lineal en el intervalo de

concentraciones esperadas para los diferentes analitos (tabla XII,

pp. 52), Y todos los coeficiente de correloclon resultantes son

significativos con 99%de confianza (t-test. valor de t=32).

En 10 que concierne 01 tratamiento de muestra este

involucra, en dos de susetapas, un procedimiento de extrocclon.

Enese punta una contribuci6n muy relevante de este estudio fue 10

cptlcoclon de sistemasde extracci6n en fase salida. En 10 literatura



63

solo habra side reportado el uso de los rnetodos tradicionales de

extrocclon liquido-Ifquido. Con el rnetodo propuesto se simplifica el

trabajo mismo que cdernos se realiza con mayor seguridad al

disminuir el volumen de solvente involucrado. Estametodologfa fue

aplicada para la extrocclon del aceite vegetal bromado

contenido en un refresco y para la recuperaci6n de los analitos

despues de la transesterificaci6n del aceite. En ambos casas se

obtienen buenos porcentajes de recuperoclon y estos se podrian

mejorar 5 1 se utiliza olqun eluente de mayor poloridad. Se sugiere

evaluar otros eluentes como podria ser el eter etflico.

En 10 que concierne a 10 corocterlzoclon de los derivados

metflicos del aceite vegetal, bromado 0no, esta se loqro en base

al rnetodo crornotoqroflco desarrollado con los estondores.

Finalmente, cabe destacar que se opllco el rnetodo

propuesto en el cnollsls de un refresco comercial con resultados

satisfactorios. De esta forma se demostr6 la factibilidad de utilizar 10

metodologia desarrollada para el onolisls de un problema real,

loqrondose la cuontltlcoclon de los diferentes esteres bromados

derivados del aceite vegetal bromado contenido en el refresco.

Cabe sefiolor que para determinar la concentrocion del aceite



64

utilizado en un refresco determinado se debe tener una muestra

del mismo para poder evaluar su composici6n; sobre todo si el

aceite no esta por completo bromado. Dicho cnollsls se lIevarfa a

cabo con el rnetodo desarrollado en este trabajo. Sl no es posible

saber cual aceite fue utilizado en un caso particular. se sugiere

evaluar una gran cantidad de aceites bromados comerciales y

obtener de eso monera una cornposlclon promedio; con esa

informacion se podrfa estimar 10 concentraci6n del aceite

contenido en el refresco en el coso especificodo. Por otro parte,

serio conveniente que 10 legislacion indicara los concentraciones

rnoxlmos permitidas para coda derivodo bromado y no para el

aceite total yo que finalmente son estos los productos sospechosos

de toxicidad y no el resto de componentes del aceite.



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APENDICES

68



APEND ICE A

CROMATOGRAMAS OBTENIDOS UTILIZANDO

E L METODO ISOCRATICO

69



70

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Figura5. Cromatograma del Linoleato de Metilo.



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Figura 6. Cromatogra ma del Linoleato de Metilo.



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Figura 8. Cromatograma del Estearato de Metila.



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Figura 14. Cromatograma del Solvente A.



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Figura 17. Cromatograma del HBEMSoluble.



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Figura 18. Cromatograma del HBEM Insoluble.



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Figura29. Cromatograma del Heptadecenoato de Metilo.



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Figura 30. Cromatograma del DBHM.



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Figura 33. Cromatograma de 10 Mezcla de Analitos (205 nm).1.-

HBEM Insoluble, 2.- Linolenato de MetHo, 3.- HBEM

Soluble, 4.- TBEM, 5.- Linoleato de Metilo 6.- DBHM, 7.-

DBEM,8.- Oleato de Metilo, 9.- Palmitato de Metilo, 10.-

Estearato de Metilo.

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Figura 35. Cromatograma de la Mezela de Analitos (220 nm). 1.-

HBEM Insoluble, 2.- HBEM Soluble. 3.-TBEM, 4.- DBHM, 5.-

DBEM,6.- Oleato de Metila. 7.- Palmitate de Metilo, 8.-

Estearato de Metilo.



84

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1.- HBEM lnsoluble

2.- ' H BEM Soluble

3.- TiBE M

4.- T B E M

5.- D B H M .

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Figura 56. Cromatograma de 10 Soluci6n No.3 Utilizada en la

Elaboraci6n de las Curvas de Calibraci6n (Metoda

Isocr6tico J .

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Figura 58. Cromatograma del Aceite de Soya: (a) Sin

esterificar, (b) Transesferificado.

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2.- Linoleato de Metilo

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Figura 59. Cromatograma del Aceife de Soya.



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1.- Unolenato de Metilo

2.- Unolea10 de Metrlo

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Figura 60. Cromatograma del Aceite de Marz.



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2.- HBEM Soluble

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4.- T B E M

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Figura 63. Cromatograma del Aceite de Soya Bromado (Metoda

Isocr6tico] .

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aceite bromado

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