ação do ultra-som de baixa intensidade sobre

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ACTA ORTOP BRAS 11(1) - JAN/MAR, 2003 17

DANIELA CRISTINA LEITEDE CARVALHO1, ALBERTO CLIQUETJR2

ARTIGO ORIGINAL

SUMMARY

Several studies have already shown the beneficial effects

of low intensity pulsed ultrasound on osteogenesis in fractu-re cases. However, few repor ts have related the ultrasoundact ion in bone with some injury but without f racture. Thus, weinduced a rat osteopenia model by ovar iec tomy and the p ro-ximal thi rd o f ra t femur was st imulated by ult rasound (200msburst of 1.5 MHz sine waves repeated at 1.0 kHz, 30mW/cm2,SATA) for 20 min/day, during 20 days.

After the treatment per iod, the body weight was signi fi-cantly higher in the non-treated group than the treated one.No significant difference in bone mineral content was detec-ted among the groups (p>0.05). Also, no significant diffe-rence was noted in the mechanical proper ties of the femoraldiaphysis. However, histologic investigations showed that thetreated femur presented less microarchitectural deteriorationthan the non-treated group. Moreover, it was demonstratedthat the treated group did show recent bone formation whichwas not there in the non-treated group. These results su-ggest that the low intensity u ltrasound can inter fere in a posi-tive way on osteoporosis.

Key words: Ultrasonics; Bone diseases, Metabolic;Calcium/analysis; Phosphorus/analysis

INTRODUCTION

Osteoporosis is a metabolic bone disorder affectingmainly the aged population, generally post-menopausal wo-men due to lack of ovarian hormone. Bony mass reduction,mainly observed in cancel lous bone, that is caused by incre-

Trabalho recebido em 29/09/2002. Aprovado em 27/11/2002

Trabalho realizado na Escola de Engenharia de So Carlos - USP, no Curso de PsGraduao Interunidades Bioengenharia e no Departamento de Ortopediae Traumatologia da Faculdade de Cincias Mdicas - UNICAMP

1- Fisioterapeuta. Mestre em Bioengenharia. Aluna de Doutorado do Cursode Ps-Graduao em Cirurgia - UNICAMP2- Professor Titular EESC - USP / FCM - UNICAMP

Endereo para correspondncia: Av. Trabalhador Socarlense, 400CEP 13566-590 - So Carlos - SPE-mail: [email protected]

Ao do ultra-som de baixa intensidade sobreossos de ratas osteopnicas

Low intensity ultrasound effects over osteopenicfemale rats bones

RESUMO

Neste estudo, ns analisamos a ao do ultra-som pul-

sado de baixa intensidade (30mW/cm2, freqncia de repe-tio de 1Khz e ciclo de trabalho de 20%) durante 20 diasconsecutivos, por 20 minutos dirios, como mtodo noinvasivo, em modelo de ratas osteopnicas. A estimulaoultra-snica foi realizada na regio proximal dos fmures,bilateralmente.

Apesar dos resultados quantitat ivos do contedo mine-ral sseo (clcio e fsforo) no terem demonstrado dife-renas significativas (p>0,05) entre os grupos tratado e notratado, as investigaes histolgicas mostraram que o f-mur tratado apresentou uma menor deteriorao microar-quitetural que o grupo no tratado, alm da ocorrncia deneoformao ssea, a qual no foi observada no grupono tratado. Os resultados sugerem que o ultra-som pulsa-do de baixa intensidade pode interferir positivamente sobrea osteoporose.

Descritores:Ultrasom; Osteopatias metablicas; Clcio/anlise;Fsforo/anlise

INTRODUO

A osteoporose uma doena ssea metablica, queatinge principalmente a populao idosa, geralmente mu-lheres ps-menopausais em decorrncia da deficincia do

hormnio ovariano. A diminuio de massa ssea, princi-palmente observada nos ossos trabeculares, causada porum aumento da atividade de reabsoro ssea pelos oste-oclastos torna os ossos mais frgeis e mais suscetveis afraturas (6) .

Work performed at Escola de Engenharia de So Carlos - (USP) at the Post-GraduateCourse in Interunidades Bioengenharia and at the Ambulatory of the Orthopedicsand Traumatology Department of Faculdade de Ciencias Mdicas - UNICAMP.

1- Physiotherapist. Master in Bioengineering. Doctorate Student at Post-GraduationCourse in Surgery - UNICAMP2- Full Professor EESC - USP / FCM - UNICAMP

Address: Av. Trabalhador Socarlense, 400CEP 13566-590 - So Carlos - SPE-mail: [email protected]


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Desta forma, tratamentos para prevenir ou estabilizar o qua-dro de osteoporose so importantes. No entanto, os tratamentosexistentes para a osteoporose so, predominantemente, farma-colgicos, os quais em alguns casos so contra-indicados oumal tolerados por determinados pacientes. Assim, tcnicas alter-nativas, no invasivas, so boas escolhas na tentativa de contro-lar a perda de massa ssea.

Baseado em princpios biomecnicos, em que cargamecnica promove deformao no osso e consequente-mente gera um estmulo para uma resposta ssea local, jpostulado por WOLLF em 1870, a utilizao do ultra-somde baixa intensidade uma alternativa para o estmulo deformao de osso, uma vez que o ultra-som uma formade energia mecnica que gera microdeformaes locais nosossos, de maneira similar s ocorridas sob fora externa (2) .Assim, a terapia com ultra-som, ao promover efeitos ben-ficos na estrutura ssea, pode ser utilizada em doenasque apresentam problemas na manuteno da massa s-sea, como nos casos de osteoporose. Muitos estudos j

mostraram a eficcia do ultra-som de baixa intensidade naacelerao do reparo de fraturas sseas recentes, em ca-sos de no-unio ssea e em pseudoartrose(3,8,9,15,17). Tam-bm foi demonstrado o efeito benfico do ultra-som de baixaintensidade em casos de fratura em pacientes com doen-as que prejudicam a recuperao ssea, como a osteo-porose e diabetes(10,16). No entanto, no existem muitos es-tudos relatando o efeito do ultra-som de baixa intensidadeem casos de osteoporose sem a ocorrncia de fraturas.

Atualmente, o modelo de rata ovarectomizada tem ga-nhado ampla aceitao para o estudo das repercusses dadeficincia de hormnio ovariano sobre o sistema esquel-tico, bem como para analisar as respostas sseas aos no-vos tratamentos.

O presente estudo foi dividido em duas partes. Na pri-meira parte foi avaliada a eficcia de um protocolo de 30dias para a induo de osteopenia no osso femural de ra-tas, aps a realizao da histerectomia e ovarectomia bila-teral. Na segunda parte, avaliamos a eficincia do ultra-sompulsado de baixa intensidade (intensidade de 30mW/cm2,freqncia de 1,5 MHz, freqncia de repetio de 1 KHz,ciclo de trabalho de 20%) sobre a regio proximal dos f-mures osteopnicos das ratas.

MATERIAIS E MTODOS

Para a primeira parte, foram utilizadas 11 ratas maduras

isognicas da raa Holstman (Rattus norvegicus albinus),com cerca de 200g de massa corprea. As ratas foramseparadas em 2 grupos: grupo controle (5 animais), com-posto por ratas no ovarectomizadas e grupo de ratas ova-rectomizadas (6 animais). As operaes foram realizadassob anestesia intramuscular, composta por Virbaxil 2%, nadose 0,04 ml/100g de massa corprea e por Francotar nadose de 0,08 ml/100g de massa corprea. Ovarectomia bi-lateral foi realizada em 6 ratas. Aps o procedimento cirr-gico, as ratas foram alimentadasad libitum durante 30 dias.Foram ponderadas as massas corpreas das ratas no in-

ase in bony reabsorption by osteoclasts changes bones morefragile and subject to fractures (6).

Considering this, treatments preventing and stabilizing thispicture are important. However, treatments currently ex ist ingfor osteoporosis are predominantly pharmacological, and in

some cases contra-indicated or poorly tolerated by somepatients. Thus, a lternat ive noninvasive techniques are a goodchoice for controlling bony mass losses.

Based on biomechanical principles, where mechanicalload induces bone deformat ion and consequentl y causesst imu lus for a local bony response, already presented byWOLLF in 1870, the use of low intensity ultrasound is an alter-nat ive for bone format ion st imula tion, since ultrasound is amechan ical energy type generating local bone micro-defor-mations, similarl y to those occurring under external forces (2).Thus, therapy with ultrasound, by promoting beneficial effectsover bony structure may be used in diseases challenging theabi li ty to keeping bony mass, such as in osteoporos is. Manystudies have already demonst rated the efficacy of low inten-

sit y ul trasound in accele rat ing healing of recent bone fractu-res , in cases of non-union and in pseudarthrosis (3,8,9,15,17). Itwas also demonstrated the beneficial effect of low intensityultrasound in cases of patients with diseases impairing bonyrecovery, such as osteoporosis and diabetes (10,16). However,there are few studies reporting effects of low intensity ultra-sound in cases o f osteoporosis without fractures.

Currently, the model of ovariectomized rat is gaining wideacceptance in the study of ref lexes of lack of ovarian hormo-ne on ske letal system, as wel l as in evaluation of bony res-ponses to new treatments.

This study was divided into two parts. In the first it wasevaluated the efficacy of a 30-day protocol for induction of

osteopenia in femoral bone of female rats, after hysterec-tomy and bilateral ovariectomy. In the second, it was evalua-ted the efficiency of pulsed low intensity ultrasound (intensityof 30 mW/cm2, frequency of 1.5 MHz, repeti tion frequency of1 KHz, work cycle of 20%), over the proximal region of oste-openic femurs of female rats.

MATERIAL AND METHODS

For the first part were used 11 mature isogenic femaleHolstman rats (Rattus norvegicus albinus), with about 200 gof body mass. The animals were divided into two groups:control (5 animals) with non-ovarectomized animals and agroup of 6 ovarectomized animals. The surger ies were per-formed under intramuscular anesthesia with Virbaxil 2% in a0.04 ml/100 g of body mass and by Francotar in a 0.08 ml/100 g of body mass doses. Bilateral ovarectomy was perfor-med in 6 female rats. After the surgery, the an imals were feedad libitum fo r 30 days. Body mass of the animals were evalu -ated in basel ine and at the end of the experiment. I n the 31st

day the animals were sacrificed, their left femur removed, cle-aned, washed in deion ized water and kept in 10% formal -dehyde solution for 48 hours. After this period the boneswere standardized at 1.5 cm length from the great trochanterand calcined, dissolved in chloride acid at 37% and dilu ted in


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cio e no final do experimento. No 31 dia, as ratas foramsacrificadas, seus fmures esquerdos retirados, limpados,banhados em gua deionizada e mantidos em formaldedo10%, durante 48 horas. Aps este perodo, estes ossos fo-ram padronizados em 1,5 cm de comprimento, a partir dotrocnter maior e foram calcinados, solubilizados em cidoclordrico a 37% e diludos em 100ml. A realizao destaetapa viabilizou a anlise do contedo mineral sseo. Paraanlise quantitativa de clcio foi utilizado espectrofotme-tro de absoro atmica por chama e para a anlise defsforo foi utilizado espectrofotmetro de absoro mole-cular em sistema de anlise por injeo em fluxo (FIA). Osfmures direitos foram descalcificados atravs de MORSE(Citrato de Sdio 20% e cido Frmico 50% - partesiguais de cada), desidratados, diafanizados e includos emparafina. Para cada pea foram realizados sete cortes seri-ados longitudinais (6 mm de espessura) da regio proximaldo fmur usando micrtomo, os quais foram excludos.Seqencialmente, foram realizados dois cortes seriados de

50 mm de espessura, para cada pea. Aps a realizaodos cortes, estes foram desparafinizados, secos em estufae fixados no suporte utilizado para a realizao da anliseem microscopia eletrnica de varredura (MEV). Os cortesforam metalizados com ouro para facilitar a condutibilidadeeltrica. Foi utilizado um equipamento LEO modelo 440.

As diferenas nas massas corpreas em ambos os gru-pos foram avaliadas com o teste T, utilizando nveis de sig-nificncia de 5%.

Na segunda parte do estudo, foram utilizadas 34 ratasisognicas da raa Holstman (Rattus norvegicus albinus),com cerca de 200g de massa corprea. Foi utilizado o mes-mo protocolo cirrgico da primeira parte do estudo. Devi-do eficcia do protocolo de ovarectomia na utilizao de30 dias para a induo de osteopenia, os tratamentos co-mearam no 31 dia aps a cirurgia. As ratas foram dividi-das em dois grupos: grupo tratado (25 animais) e grupoplacebo (9 animais). No grupo experimental tratado, as ra-tas foram submetidas a aplicaes de ultra-som com inten-sidade espacial e temporal mdia de 30mW/cm2. O equipa-mento utilizado foi fixado na mesa de suporte, onde as ra-tas eram imobilizadas. O cabeote possuiu dimenses nor-mais para possibilitar que a aplicao de ultra-som fosserealizada ao mesmo tempo, em ambas patas traseiras,abrangendo a regio desde a cabea femural at tero dis-tal do fmur. Foi utilizado gel para facilitar a conduo docampo ultra-snico. Calibrao do equipamento foi realiza-

da previamente sua utilizao no experimento.Os animais do grupo placebo no foram submetidos ao

tratamento ultra-snico, mas sofreram as mesmas interfernci-as que o estresse pode causar aos animais. Para isso, perma-neceram durante 20 minutos imobilizados por 20 dias conse-cutivos. O mesmo perodo usado para o tratamento com oultra-som nas ratas do grupo tratado.

Os sacrifcios ocorreram 1 dia aps o trmino do tratamen-to, seus fmures esquerdos retirados e submetidos ao ensaiomecnico de flexo de trs pontos para determinar as proprie-dades mecnicas dos ossos. Foi utilizado equipamento MTS

100 ml. This phase allowed the evaluation of the bony mineralcontent. For quantitative analysis of calcium it was used aflame atomic absorption spectrophotometer and for phos-phorus analysis a molecular absorp tion in an flow inject ionanalysis (FIA) system spect rophotometer. The right femurswere decalcified by MORSE (Sodium citrate 20% and Formicacid 50% - equal par ts) dehydrated and included in para ff in.For each piece seven serial longitudinal cuts were performed(6 mm thick) of prox imal femur region by means of a microto-me that were excluded. Sequentially were per formed two se-rial cuts of 50 mm thick for each piece. After the cuts , thesewere de-paraffined, dried in stove and fixed to a support usedfor electronic microscopic evaluation. The cuts were goldmetal lized in order to fac il itate electr ical conduction. A LEOmodel 440 equipment was used.

The differences in body mass in both groups were evalu-ated with T test, with a 5% s ignificance level.

In the second part of the study, 34 isogenic female Hols t-man rats (Rattus norvegicus alb inus), with about 200 mg of

body mass, were used. Se same surgical protocol of the f irs tstudy par t was perfo rmed. Due to the ef ficacy of the 30 daysovariectomy protocol for induction of osteopenia, the treat-ments started a t the 31st day after the surgery. The rats weredivided into two groups: a group treated (25 animals) and acontrol group (9 animals). In the treated group, the rats un-derwent ultrasound with a spatial and temporal intensity of 30mW/cm2in average. The equipment used was fixated to thesupport tab le, where the rats were immobi lized. The headhad normal size allowing the ultrasound app licat ion to beperformed at the same t ime in both hind-feet involving a regi-on from femoral head to distal third of femur. A gel was usedin order to enable the u ltrasound field conduction. The equi-pment was calibrated prev iously to i ts use in the exper iment.

The animals in control group did not underwent ultrasoundtreatment, however suffered the same interference stress cancause to animals. For this, they were immobilized for 20 mi-nutes dur ing 20 consecut ive days, that i s, the same as withthe treated animals.

Animals were sacrif iced 1 day a fte r the treatment ended,and thei r le ft femurs removed and submit ted to a three-pointflexion mechanical assay in order to determine their mechani-cal properties. A MTS TestStart II equipment was used for themechanica l assay. The bones were laid over the ir extremitiesover two supports with 18 mm distance. The speed of loadapplication was 5 mm/min using a 100 Kgf load cell . Foreach load increase applied to the bone, it was retrieved the

deformation caused, allowing to plot a load versus deforma-tion curve. Through this curve, it was possible to evaluatemechanica l properties such as maximal deformation, rigidity,resi liency and tenacity (Figure 1). The parameters were calcu-lated by means of the Mathemat ics 2.2 software. After theflexion assay, the femurs were standardized at 1.5 cm lengthfrom the great trochanter and prepared for a quantitative analy-sis of calc ium and phosphorus. In each pot were placed twobones, except in some cases in it was necessary to put threebones. The right femurs were taken apart for common lightmicroscopy and electronic microscopy. Af ter preparation, the


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modelo TestStart II para ensaio mec-nico. Os ossos foram apoiados emsuas extremidades, sobre dois supor-tes distanciados 18mm. A velocidadede aplicao da carga foi 5mm/min e

utilizada clula de carga de 100 Kgf.Para cada aumento de carga aplicadano osso se obtm a deformao ge-rada, o que possibilita a construodo grfico carga versus deformao.Atravs do grfico foram analisadaspropriedades mecnicas como: defor-mao mxima, rigidez, resilincia e te-nacidade (Figura 1). Os parmetrosforam calculados usando o softwareMathematics, verso 2.2. Aps o en-saio de flexo, os fmures foram pa-dronizados em 1,5 cm de comprimen-to, a partir do trocnter maior e prepa-

rados para anlise quantitativa de cl-cio e fsforo. Em cada cadinho fo-ram colocados dois ossos, excetoem alguns casos em que foi neces-srio colocar trs ossos. Os fmu-res direitos foram separados paraanlise de microscopia de luz co-mum e MEV. Aps o preparo das pe-as, foram realizados sete cortes se-riados longitudinais (6 mm de espes-sura) da regio proximal do fmurusando micrtomo, sendo as lmi-nas coradas com Tricmico de Mas-son (TM). Seqencialmente, foram

realizados dois cortes seriados de50 mm de espessura, os quais fo-ram preparados para serem anali-sados por MEV. Foram ponderadasas massas corpreas das ratas noincio e no final do experimento.

Para comparar as diferenas de mas-sas corpreas das ratas foi utilizado testeT e para comparar as variveis mecni-cas e a quantidade de material mineral s-seo (clcio e fsforo) entre os grupos es-tudados foi aplicada a anlise de varincia(ANOVA). Os dados submetidos anli-

se estatstica utilizaram nveis de significncia de 5%.

RESULTADOS

Primeira parte do estudo: No momento do sacrifcio, ob-servou-se um ganho significativo das massas corpreasdas ratas ovarectomizadas comparado com o das ratascontrole (Tabela 1).

Atravs da anlise quantitativa de clcio e fsforo dos fmuresdos animais dos dois grupos experimentais, observou-se que asratas do grupo controle apresentaram maior quantidade de clcio

Figura 1 - Exemplo de grfico carga versusdeformao. LP: limite proporcional (ponto

final da regio elstica); LR: limite de ruptura(limite mximo); rea do tringulo O-A-LP:

resilincia; tangente do ngulo O: rigidez; reatotal sob a curva O-LP-LR: tenacidade.Figure 1 - Graphic example of load vs

deformation. LP: proportional limit (end pointof elastic region); LR: rupture limit (maximum

limit); triangle O-A-LP: resiliency; tangentto O angle: rigidity; total rea under the

curve O-LP-LR: tenacity.

Tabela 1 - Valores mdios e desvios padres(DP) das massas corpreas dos dois

grupos experimentais.Table 1 - Mean and standard deviation (DP)

values of body mass of both experimental groups.

Figura 2 - Quantidades de clcio e fsforo emg/kg dos grupos controle e ovarectomizado.

Figure 2 - Quantities of calcium andphosphorus in g/kg of the control and

pieces were cut longitudinal ly (6 mmthick) from proximal femur region bymeans of a microtome, and the flakesstained with Masson Tricromion.

Sequentially, serial cuts were per-

formed at 50 m thick, and preparedto be analyzed under electronic mi-croscopy. The body mass were wei-ghted from basel ine to the end of theexperiment.

In order to compare the female ratsbody mass it was used the T test; forcomparing mechanical variables andbony mineral contents (calcium andphosphorus) between the groups, thevariance analysis (ANOVA). Significan-ce level was 5%.

RESULTS

First study part: at the time ofthe sacrifice it was observed a signi-ficant increase in body mass of ova-rectomized female rats as shown in(Table 1).

By means of a quantitative analysisof calcium and phosphorus of the fe-mur of animals from both experimentalgroups, it was observed that rats fromcontrol group had a higher amount ofcalcium and phosphorus (average: cal-cium, 180.59 g/kg; phosphorus 90 g/kg) in comparison to the group of ova-rectomized rats (average: calcium,140.94 g/kg and phosphorus, 73.49 g/kg). There was a 21.956% reduction incalcium and 18.34% in phosphorus inthe ovarectomized rats in comparisonto the control ones (Figure 2).

By means of electronic microsco-py it was possible to compare thestructural dif ferences between femurof control and ovarectomized groups( Figures 3) shows the differences in

cancellous structures between the groups. Through the com-par ison it is possible to observe tha t the bony t rabeculae inovarectomized female rats are more spaced and with redu-ced conectivities in comparison to the normal rats group,characterizing a larger bony reabsorption by osteoclasts intrabecullary plates.

Second part of the study: (Table 2) presents the meanand SD values of the body mass measurements of femalerats in cont rol and t reated g roups, in baseline and at the endof the trial. Statistically significant differences (p= 0.005) inbody mass gain between both groups were observed, larger


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e fsforo (mdias: 180,59 g/kg de clcio; 90g/kg de fsforo) quando comparados com ogrupo de ratas ovarectomizadas (mdias:140,94 g/kg de clcio e 73,49 g/kg de fsfo-ro). Ocorreu diminuio de 21,956% de clcio

e 18,34% de fsforo nas ratas ovarectomiza-das comparado com as ratas do grupo con-trole (Figura 2).

Atravs da microscopia eletrnica de var-redura foi possvel comparar as diferenasestruturais dos fmures das ratas dos gruposcontrole e ovarectomizado. A (Figura 3) mos-tra as diferenas, entre os grupos, da estrutu-ra trabecular dos fmures das ratas. Atravsde comparao, possvel observar que astrabculas sseas existentes no fmur de rataovarectomizada esto mais espaadas e comsuas conectividades reduzidas comparadocom o grupo de ratas normais, caracterizan-

do uma maior reabsoro ssea pelos oste-oclastos nas placas trabeculares.

Segunda parte do estudo:A (Tabela 2) mos-tra os valores mdios e DP das medidas demassa corprea das ratas dos grupos placeboe tratado no incio e no final do experimento. Ob-servam-se diferenas estatisticamente significa-tivas (p = 0.005) no ganho de massa corpreaentre os dois grupos, sendo maior nas rataspertencentes ao grupo placebo.

Atravs do ensaio de flexo foi possvelconstruir grficos de carga versus deforma-o (Figuras 4 e 5) e, assim, obter e comparar

os valores das propriedades mecnicas dasdifises femorais dos ossos de diferentes gru-pos experimentais. A tabela 3 mostra os valo-res mdios e os DP das propriedades mec-nicas dos fmures das ratas dos dois gruposexperimentais: placebo e tratado. Observa-se que no ocorreram diferenas estatistica-mente significativas quando relacionadas asvariveis mecnicas e os grupos estudados (carga mximap=0,5603; deformao mxima p=0.1551; rigidez p=0.0546; re-silincia p=0.5835; tenacidade p=0.2926).

As anlises quantitativas de clcio e fsforo realizadas mos-traram que o grupo de ratas ovarectomizadas submetidas ao

tratamento de ultra-som de baixa intensidade alcanaram valo-res no estatisticamente significativos comparado com os va-lores obtidos nas ratas do grupo placebo (p = 0.734 paraclcio; p = 0.396 para fsforo). A tabela 4 mostra os valores declcio e fsforo dos dois grupos experimentais.

As figuras 6-AB e 6-CD comparam a regio da cabea femuralentre o grupo placebo e tratado. A colorao com tricrmico deMasson possibilita estudar a idade ssea, sendo que ossos ma-duros se coram em azul e os ossos imaturos se coram em ver-melho. possvel observar que, no grupo placebo a matriz ssea predominantemente formada por osso maduro, no indicando

Figura 3 - A) Microscopia eletrnicade varrredura da cabea femural de

rata controle; B) Microscopiaeletrnica de varredura da cabeafemural de rata ovarectomizada.

Elipses indicam diferenas estruturaisentre os grupos. Observam-se poros

mais profundos e de maioresdimenses no grupo ovarectomizado

comparado com grupo controle.Aumento de 100x.

Figure 3 -A) Electronic microscopy of

control female rat femoral head; B)Electronic microscopy ofovarecnomized female rat femoral

head. The ellipsis indicate the structuraldifferences between the groups. Deeper

and larger dimension pores areobserved in the ovarectomized group in

comparison to the control group.Magnification 100x.

in the cont rol animals.

By means of the flexion assay it waspossible to plot curves load versus defor-mation (Figures 4 and 5), so obtaining andcomparing the values of mechanical pro-

perties o f femoral shafts from dif feren t ex-perimental groups. Table 3 shows the meanvalues and SD of mechanical properties offemale rats in both groups: control and tre-ated. I t is observed that there were no s ta-tistically significant differences when me-chanical variables were compared (maxi-mum load p = 0,5603; maximum defor-mat ion p=0.1551; rig idi ty p=0.0546; resi-liency p=0.5835; tenacity p=0.2926) .

The quantitative calcium and phospho-rus analys is showed that the group of ova-rectomized female rats that underwent lowintensity ultrasound treatment reached non-stat istical ly signi ficant val ues in compari-son to those found in control an imals (cal -cium, p=0.734; phosphorus, p=0.396).(Table 4) shows calcium and phosphorusvalues in both groups.

Figures 6-AB and 6-CD compare thefemoral head region between the controland treated groups. Masson Tricromiumst aining al lows studying the bony age.Mature bone is stained in blue and imma-ture ones in red. It is possible to observethat, in control group, bony matrix is pre-dominantly formed by mature bone, without

indication of recent bony formation. In thetreated group, there are neo-bony formati-on zones, indicating active osteoblasts.The increase in the osteoblastic activity wassubjectively observed, without the use ofmorphometric methods.

Images obtained by electronic micros-copy show structural differences of the fe-

moral head region between control and treated group. It ispossib le to observe structural di fferences between the expe-rimental groups, with a larger loss o f trabecullar bone in con-trol group (Figures 7 and 8).

DISCUSSION

Ovarectomized female rats is an useful model due to pre-senti ng biological mechan isms that are s imilar to those oc-curring in osteoporotic women(11,14). This study showed thatthe ovarian hormone deficiency for 30 days leads to bonyloss in mature fema le rats , and a body mass increase that isstati st icall y signi fican t in comparison to the control g roup (p< 0.05), supporting the literature reports showing that ovari-ectomy causes metabolic changes responsible for a pro-nounced increase in food intake and body mass (as a con-


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formao ssea recente. No grupotratado, observam-se regies comneoformao ssea, o que indica os-teoblastos ativos. O aumento da ati-vidade osteoblstica foi subjetivamen-te observado, no se utilizando m-todos morfomtricos.

As imagens obt idas por MEVmostram as diferenas estruturais daregio da cabea femural entre osgrupos placebo e tratado. possvelobservar diferenas estruturais entreos grupos experimentais, com maiorperda de osso trabecular no grupoplacebo (Figuras 7 e 8).

DISCUSSO

A rata ovarectomizada um mo-delo til devido ao fato de apresentarmecanismos biolgicos similaresaqueles ocorridos em mulheres os-teoporticas(11,14). O presente estudomostrou que a deficincia do horm-nio ovariano durante 30 dias promo-ve perda ssea nas ratas maduras,alm de um ganho de massa corp-rea, estatisticamente significativo,quando comparado com o grupocontrole (p < 0,05), corroborandocom os relatos da literatura que de-monstraram que a ovarectomia pro-

voca alteraes metablicas respon-sveis pelo aumento pronunciado daingesto alimentar e massa corprea(em conseqncia do aumento degordura corprea)(5,18,19). O ganho demassa corprea maior em ratasovarectomizadas comparado comratas intactas mesmo em condiessimilares de ingesto alimentar(5,13).

Atravs da anlise por MEV foipossvel observar diferenas estrutu-rais entre os fmures dos grupos con-trole e ovarectomizado. Estes acha-dos roboram os estudos que tam-bm observaram perda ssea trabe-cular em conseqncia da carnciade hormnio ovariano(1,6,7,18).

Aps analisar a eficincia do proto-colo de ovarectomia, foi estudado oefeito do ultra-som de baixa intensida-de sobre ossos osteopnicos. Os nos-sos resultados mostraram um ganhode massa corprea estatisticamente significativo no grupo experi-mental placebo (p = 0,005) quando comparado com o grupo trata-do, o que estabelece uma correlao entre o ultra-som e um menor

Tabela 2 - Valores mdios e DP das medidascorpreas dos dois grupos experimentais.

Table 2 - Mean and DP values of body measures ofboth experimental groups.

Tabela 3 - Propriedades mecnicas dos fmures dasratas dos dois grupos experimentais (mdia DP).

Table 3 - Mechanical properties of female ratsfemurs from both experimental groups (mean + DP).

Tabela 4 - Valores mdios e DP das quantidades declcio e fsforo dos fmures das ratas dos dois

grupos experimentais.

Table 4 - Mean and DP values of the amounts ofcalcium and phosphorus of female rats femurs from

both experimental groups.

Figure 4 - Grfico FxD dos fmures das ratasdo grupo placebo (mdia DP).

Figure 4 - FxD graphic of placebo groupfemale rats femurs (mean + SD).

sequence of increase of bodyfat) (5,18,19). The body mass increaseis higher in ovarectomized rats incomparison to intact female rats insimilar food- intake condi tions (5,13).

By means of electronic micros-copy analysis it was possible toobserve structural differences be-tween the femurs of control andovarectomized groups. The findin-gs support the results of studiesthat also found trabecullar boneloss in consequence of lack of ova-rian hormone (1,6,7,18).

Af ter the ana lysis of the ef fici-ency of the ovariectomy protocol,it was studied the effect of low in-tensity ultrasound on osteopenicbones. Our result s showed an in-

crease in body mass that was sta-tistically significant in the controlgroup (p = 0.005) in comparisonto the treated group, establishing acorrelation between ultrasound anda lower body mass increase. Ho-wever, there were not found in theli tera ture works correlat ing ul tra-sound to body mass in ovarecto-mized animals.

Flexion test results had no sta-tistically significant differences (p >0.05) in relation to the several stu-

died mechanic variables. The treat-ment did not interfere in femoralshaft mechan ic propert ies. Ultra-sound may have no t st imulated anincrease in the bony mineral con-tent, and consequently in femoralshaft bony endurance, due to a lo-wer change in bony metabolism inreg ions wi th predominance of cor-tical bone, making them less sen-si tive to ul trasound stimul i.

Quantitative results of mineralcontent did not show a s ignificantincrease of calc ium and phospho-

rus in osteopenic bone of femalerats treated wi th low in tensit y ultra-sound in comparison to non-trea-ted control female rats. Neverthe-less this quantitative analysis failedto show statistically significant di-fferences (p > 0.05) in comparisonof the groups, qualitative findings

pointed to s tructura l di fferences between the groups.

The histological analysis (stained with Masson Tricro-mium) showed bony neoformation in the treated group which


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ganho de massa corprea. No entan-to, no foram encontrados na literatu-ra trabalhos relacionando o ultra-soma massa corprea em animais ova-rectomizados.

Os resultados do teste de flexono apresentaram diferenas signifi-cativas (p > 0.05) quando relaciona-das as variveis mecnicas aos gru-pos estudados. O tratamento no in-terferiu nas propriedades mecnicasda difise femural. O ultra-som talvezno tenha estimulado o aumento docontedo mineral sseo e, conse-quentemente, da fora ssea na difi-se femural devido menor alteraodo metabolismo sseo nas regiescom predominncia de osso cortical,o que as torna menos sensveis ao estmulo ultra-snico.

Os resultados quantitativos do contedo mineral no de-monstraram um aumento significativo de clcio e fsforo nosossos osteopnicos das ratas tratadas com ultra-som de bai-xa intensidade comparado com ossos de ratas no tratadas.Embora esta anlise quantitativa no tenha mostrado diferen-as estatisticamente significativas (p>0.05) ao comparar osgrupos experimentais, os achados qualitativos apontaram di-ferenas estruturais entre os grupos.

Figura 5 - Grfico FxD dos fmures das ratasdo grupo tratado (mdia DP).

Figure 5 - FxD graphic of treated groupfemale rats femurs (mean + SD).

Figura 6 - A-B) Fotomiografia de tecido sseo da regio proximaldo fmur de ratas do grupo placebo; setas indicam matriz sseaformada por osso maduro (trabculas totalmente coradas em

azul); C-D) Fotomiografia de tecido sseo da regio proximal dofmur de ratas do grupo tratado; as setas indicam neoformao

ssea (regies trabeculares coradas em vermelho). Cortelongitudinal. Colorao TM. Aumento de 160x.

Figure 6 - A-B) Photomicrography of placebo group female ratsproximal femur bony tissue; arrows indicate bony matrix formed bymature bone (completely stained in blue); C-D) Photomicrography

of treated group female rats proximal femur bony tissue; arrowsindicate bony neoformation (trabecullary region stained in red).

Sagittal cut. Staining: TM. Magnification 160x.

was not observed in the controlgroup.

By means of electronic mi-croscopy it could be noticed thatin the group treated with low in-

tensity ultrasound, bony micro-ar-chitecture appears to be morepreserved than the one in the con-trol group, with less bony trabe-cullar loss, making it to appear asmore dense.

From the quantitative and qua-li tat ive obtained data, it can bepresumed that treatment with lowintensity ult rasound in osteopenicbone lead to an improvement inthe bony trabecullate. Qualitativeresult s showed a s light improve-

ment of the architecture of treated bone. However, th is incre-

ase and/or preservation of the mineral content was not quan-

Figura 8 - A) Microscopia eletrnica de varredura da cabeafemural de rata grupo placebo. As setas indicam maior destruio

da microarquitetura ssea comparado com o grupo tratado; B)Microscopia eletrnica de varredura da cabea femural de rata

grupo tratado. Aumento 200x.Figure 8 - A) Electronic microscopy of placebo group female ratfemoral head. Arrows indicate a larger destruction of bony micro-

architecture in comparison to the treated group; B) Electronicmycroscopy of treated group female rat femoral head.

Magnification 200x.

Figura 7 - A) Microscopia eletrnica de varredura da cabeafemural de rata do grupo placebo; B) Foto da cabea femural do

grupo tratado. Elipses indicam a diferena estrutural entre osgrupos. Pode-se observar, no grupo placebo, trabeculado sseo

mais separados. Aumento 100x.Figure 7 - A) Electronic microscopy of placebo group female rat

femoral head; B) Photography of femoral head of the treatedgroup. Ellipsis indicate the structural difference between the

groups. It can be observed in group placebo a more scarce bonytrabecullate. Magnification 100x.


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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1- Canotilho MM. Osteoporose experimental em ratas. Efeitos daadministrao crnica de cido acetilsaliclico. [Dissertao], SoCarlos: Universidade Federal de So Carlos; 1996.

2- Carvalho DCL, Carvalho MM, Cliquet A Jr., Osteoporose por desu-so: aplicao na reabil itao do lesado medular. Acta Ortop Bras9:34-43, 2001.

3- Colombo SJM. Efei tos da variao da intensidade acstica daconsolidao ultra-snica de fraturas experimentais. [Disserta-o], So Carlos: Campus de So Carlos, Universidade de SoPaulo; 1992.

4- Cowin SC. Cortical bone. In: Cowin SC. Bone Mechanics. Flrida:CRC Press, 1989. p.98-142.

5- Danielsen CC, Mosekilde L, Svenstrup B. Cortical bone mass,composition, and mechanical properties in female rats in relation toage, long-term ovariectomy and estrogen substitution. Calcif TissueInt 52:26-33, 1993.

6- Dempster DW. Bone remodeling. In: Riggs BL, Melton LJ. Osteopo-rosis: etiology, diagnosis, and management. 2nded. Philadelphia: Li-ppincott-Raven Publishers, 1995. p.67-91.

7- Devlin H, Ferguson MW, Carter DH. Cancellous bone resorption inthe proximal ilium of the ovariectomized rat. Calcif Tissue Int 46:395-400, 1990.

8- Duarte LR. The Stimulation of Bone Growth by Ultrasound. ArchOrthop Trauma Surg 101: 153-159, 1983.

9- Dyson M. Brookes M. Stimulation of Bone Repair by Ultrasound.Ultrasound Med Biol 2(Suppl.):61-66, 1983.

10- Frankel VH. Results of prescription use of pulse ultrasound therapy

in fracture management. In: Szabo Z et al., eds. Surgical Technolo-gy international. Washington: Universal Medical Press, 1998. p. 389-393. (VII Orthopaedic Surgery).

11- Frost HM, Jee WS. On the rat model of human osteopenias andosteoporosis. Bone Miner 18: 227-236, 1992.

12- Hadjidakis D, Lempert UG, Minne HW, Ziegler R. Bone loss inexperimental diabetes. Comparison with the model of inflammationmediated osteopenia. Hormon Metab Res 25: 77-81, 1993.

13- Kalu DN, Liu CC, Hardin RR, Hol lis BW. The aged rat modelof ovarian hormone deficiency bone loss. Endocrinology 124:7-16, 1989.

14- Kalu DN. The ovarectomized rat model of postmenopausal boneloss. Bone Miner 15: 175-192, 1991.

15- Kristiansen TK, Ryaby JP, McCabe J, Frey JJ, Roe LR. Ac-celerated healing of distal r adial fractures with the use of spe-cific, low-intensity ultrasound. J Bone Joint Surg Am 79:961-

973, 1997.16- Mayr E, Frankel V, Rter A. Ultrasound - an alternative healing

method nonunions? Arch Orthop Trauma Surg 120:1-8, 2000.

17- Pilla AA, Mont MA, Nasser PR, et al. Non-invasive low-intensitypulsed ultrasound accelerates bone healing in the rabbit. J OrthopTrauma 4:246-253, 1990.

18- Thompson DD, Simmons HA, Pirie CM, Ke HZ. FDA Guidelinesand animal models for osteoporosis. Bone 17(suppl):125-133, 1995.

19- Wronski TJ, Schench PA, Cintron M, Walsh CC. Effect of bodyweight on osteopenia in ovariectomized rats. Calcif Tissue Inter40:155-159, 1987.

A anlise histolgica (colorao com Tricrmico de Mas-son) mostrou a ocorrncia de neoformao ssea no grupotratado, a qual no foi observado no grupo placebo.

Atravs da MEV pde-se notar que, no grupo tratado comultra-som de baixa intensidade, a microarquitetura ssea apa-

renta estar mais preservada que a do grupo sem tratamento,com uma menor perda de trabeculado sseo, o que torna oseu aspecto mais denso.

Atravs dos resultados quantitativos e qualitativos obtidos pode-se presumir que o tratamento com ultra-som de baixa intensidade emossos osteopnicos propiciou uma melhora do trabeculado sseo.Os resultados qualitativos mostraram uma discreta melhora da ar-quitetura dos ossos submetidos ao tratamento. No entanto, esteaumento e/ou preservao do contedo mineral no foi observadode forma quantitativa. Assim, pode-se supor que a anlise quantita-tiva no tenha apontado diferenas devido ao fato de existir grandequantidade de tecido neoformado, o qual ainda no est totalmentemineralizado(4,12). Talvez a durao do tratamento com ultra-som debaixa intensidade no tenha sido suficiente para possibilitar a total

mineralizao das regies estimuladas, o que no permitiu observarestas alteraes de forma quantitativa.

AGRADECIMENTOS

FAPESP (#96/12198-2) e CAPES pelo suporte financeiroconcedido.

titatively observed. Thus, it can be supposed that the quanti-tative analysis did not demonstrate any difference due to thepresence of la rge quanti ties of new formed not yet mineral i-zed bone 4, 12. Perhaps the duration of the low intensity ultra-sound treatment was not suffi cient for a llowing the total mi-neralization of the st imulated regions, preventing these chan-ges to be quant ita tivel y observed.

AKNOWLEGEMENTS

To FAPESP (#96/12198-2) and to CAPES for financialsupport.

ação do ultra-som de baixa intensidade sobre

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