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A INTERAÇÃO ENTRE IMIDACLOPRIDE E Beauveria bassiana NA RESPOSTA COMPORTAMENTAL DE Acromyrmex subterraneus

subterraneus (HYMENOPTERA:FORMICIDAE:ATTINI)

JEFFERSON PIRES GALVANHO DA COSTA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO CAMPOS DOS GOYTACAZES

JUNHO – 2009




Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, para obtenção do grau de Mestre em Biociências e Biotecnologia.

Orientador: Prof. Dr. Richard Ian Samuels. Co-Orientadora: Prof.a Dr.ª Marinete Pinheiro Carrera.

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO CAMPOS DOS GOYTACAZES

JUNHO – 2009




Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, para obtenção do grau de Mestre em Biociências e Biotecnologia.

COMISSÃO EXAMINADORA

Flávia Regina Cruz Dias (DSc em Produção Animal)

Terezinha M. C. Della Lucia - UFV

(DSc em Fitotecnia)

Ana Maria Matoso Viana – UENF DSc em Biologia do Comportamento

Marinete Pinheiro Carrera – UENF

DSc em Psicobiologia (Co-orientadora)

Richard Ian Samuels – UENF

PhD em Entomologia (Orientador)

iii

“[...] Porque ficamos mais autênticas quanto mais nós nos parecemos com o que sonhamos que somos.”

Pedro Almodóvar (Tudo sobre Minha Mãe).

iv

DEDICO

Em especial à minha vovó Nina por ter me amado tanto e por ter sido minha referência de caráter e bondade. À minha mãe Sheyla, ao meu pai Jamesson e ao meu avô Wallace, motivos da minha existência. Ao meu amigo Thiago Santos por muito ter me auxiliado durante este curso de mestrado.

v

AGRADECIMENTOS

A Deus e às Energias da Natureza que me regem, guiam e são parte de mim.

Ao professor orientador Doutor Richard Ian Samuels, que deu todo suporte para o

desenvolvimento deste trabalho acadêmico.

À minha co-orientadora Doutora Marinete Pinheiro Carrera pelo desempenho na

construção desta dissertação.

À Doutora Denise D. O. Moreira, que com sua bagagem de conhecimento colaborou

tanto na construção da metodologia quanto nos procedimentos experimentais.

À minha amiga Liana Wermelinger de Matos por ter me auxiliado em todos os

momentos que em que eu necessitei.

À minha amiga Flávia por ter me ensinado um tudo que sabia.

Ao meu amigo Fabiano Gomes por todo apoio e incentivo.

vi

SUMÁRIO RESUMO.....................................................................................................................ix

ABSTRACT..................................................................................................................xi

I – INTRODUÇÃO...................................................................................................1

1.1 – As formigas cortadeiras ............................................................................1

1.1.1 – Divisão de trabalho.................................................................................3

1.1.2 – Estratégia de defesa da colônia..............................................................3

1.1.3 – Sistemas de defesa de formigas cortadeiras...........................................4

a) Comportamental........................................................................................4

a.1) Tratamento do material vegetal............................................................4

a.2) Cuidados com o jardim de fungo..........................................................5

a.3) Comportamento de limpeza..................................................................5

b) Químico.....................................................................................................6

1.1.4 – Controle químico de formigas.................................................................6

1.2 – O uso de fungos entomopatogênicos em controle biológico .................8

1.2.1 – O uso de Beauveria bassiana no controle de pragas..............................8

1.2.2 – O uso de fungos entomopatogênicos para o controle de

formigas................................................................................................................9

1.3 – Imidaclopride ..............................................................................................10

1.3.1 – Acetilcolina.............................................................................................10

1.3.2 – Receptor Nicotínico................................................................................11

1.4 – A combinação de fungos entomopatogênicos com o inseticida

imidaclopride ......................................................................................................12

vii

1.5 – Hipótese .....................................................................................................13

II – OBJETIVOS ...................................................................................................14

2.1 – Objetivos Gerais ........................................................................................14

2.2 – Objetivos Específicos ...............................................................................14

III – MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................15

3.1 – Insetos ........................................................................................................15

3.2 – Inseticida ....................................................................................................16

3.3 – Fungo Entomopatogênico ........................................................................16

3.4 – Testes............................. ............................................................................16

3.5 – Experimento 1 Efeitos da administração de imi daclopride e do fungo

Beauveria bassiana e da associação sobre o comportamento de limpeza e

de locomoção de A. s. subterraneus................................................................19

3.5.1 – Tratamentos..........................................................................................19

3.6 – Experimento 2: Efeito da Administração do Imi daclopride e do Fungo

Beauveria bassiana no Comportamento de Formigas Observadas em

Grupo ...................................................................................................................20

3.6.1 – Tratamentos..........................................................................................20

IV – RESULTADOS .............................................................................................22

4.1 – Experimento 1: Efeitos da administração de im idaclopride e do fungo



4.1.1 – Tratamento com Imidaclopride (IMI)......................................................22

4.1.2 – Tratamento com Fungo.........................................................................24

4.1.3 – Tratamento com IMI + Fungo................................................................25

4.1.4 – Comparação entre os efeitos da aplicação de somente IMI e de IMI +

fungo sobre o comportamento locomotor e de auto-limpeza de formigas.........27

viii

4.2 – Experimento 2: Efeito da administração do Imi daclopride e do Fungo

Beauveria bassiana no comportamento de formigas observadas em

grupo ...................................................................................................................28

4.3 – Comparação dos comportamentos de auto-limpeza e locomoção entre

formigas submetidas ao fungo e observadas individua lmente e observadas

em grupo ..............................................................................................................35

V – DISCUSSÃO...................................................................................................38




5.2 – Experimento 2: Efeitos da administração do im idaclopride e do fungo

Beauveria bassiana no comportamento de formigas observadas em

grupo ...................................................................................................................43

VI – CONCLUSÃO ...............................................................................................48

VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................50

ix

RESUMO

As formigas cortadeiras são insetos de interesse econômico por serem pragas de

diversos tipos de plantações. Uma possível ferramenta para o controle destes

insetos seria a associação de doses sub-letais de imidaclopride (IMI) com esporos

de fungos entomopatogênicos. Por isso, este trabalho objetivou verificar o efeito do

IMI e do fungo Beauveria bassiana tanto sob os comportamentos de locomoção e de

auto-limpeza [experimento (exp) 1], quanto sob os comportamentos agonísticos de

limpeza coletiva e de antenação [exp 2]. Para isso, utilizou-se operárias de tamanho

máximo de A. subterraneus subterraneus, o inseticida IMI nas doses de 10, 20 e 40

ng/kg e a suspensão conidial do fungo a 1x108 conídios/ml. O IMI foi administrado

por via tópica no tórax e o fungo foi administrado pelo contato das formigas com um

papel filtro impregnado com a suspensão conidial. Todas as formigas se

aclimataram por um período de 1 hora e receberam seus respectivos tratamentos ao

longo de 4 horas. No exp1 as formigas receberam os seguintes tratamentos: IMI10

(10 ng/kg), IMI20, IMI40, suspensão do fungo (F), IMI10+F, IMI20+F ou IMI40+F. No

exp2 uma formiga tratada com fungo foi colocada no meio de 10 formigas controles

(formando o grupo 10CONT+1F) ou no meio de 10 formigas tratadas com IMI10

(formando o grupo 10IMI+1F). Os comportamentos foram registrados após os

tratamentos e processados pela ANOVA para medidas repetidas, as diferenças

foram verificadas utilizando-se o teste de Duncan. Para o exp1, os resultados

mostraram que os grupos de significância estatística foram o IMI10, o IMI10+F e o F.

O grupo IMI10 apresentou maior atividade locomotora e menor tempo de auto-

limpeza, quando comparado ao seu controle e aos grupos IMI20 e IMI40. O mesmo

se aplica ao IMI10+F, só que quando comparado ao seu controle e aos grupos

x

IMI20+F e IMI40+F. Entretanto, o grupo F apresentou menor atividade locomotora e

exacerbação do tempo de auto-limpeza, quando comparado ao seu controle. Para o

exp2, os resultados mostraram que a presença da formiga tratada com F inibiu os

atos agonísticos e exacerbou a limpeza coletiva e a antenação das formigas

controles (10CONT+1F). Porém, a alteração do desenho experimental de 10 CONT

para 10IMI (grupo 10IMI+1F) resultou na inversão dos comportamentos, ou seja,

exacerbação da agressão e redução no tempo de limpeza coletiva e de antenação

que as formigas infectadas com fungo receberam das 10 formigas tratadas com IMI

(10IMI+1F). Portanto, o IMI bloqueou os comportamentos produzidos pelo fungo em

formigas observadas individualmente e alterou o padrão da interação social das

formigas infectadas observadas em grupo. Isso permite supor que o IMI pode ser

uma boa ferramenta para auxiliar o controle de formigas cortadeiras.

Palavras-chave: Acromyrmex subterraneus subterraneus, imidaclopride, Beauveria

bassiana, atividade locomotora, comportamentos de limpeza, interação social e

controle biológico.

xi

ABSTRACT

Leaf-cutting ants are insects of economic interest because they are pests of various

types of plantations. A possible tool for the control of these insects could be the

combination of sub-lethal doses of imidacloprid (IMI) with spores of

entomopathogenic fungi. Therefore, this study aimed to determine the effect of IMI

and of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana on the locomotion and self-

grooming behavior of the ants [experiment (exp) 1], and also on the agonistic

behaviors, allogrooming and antennal contact of ants in a group situation [exp2]. For

this, the major caste of A. subterraneus subterraneus was used, IMI doses of 10, 20

and 40 ng/kg and conidial suspensions of the fungus at a concentration of 1x108

conidia/ml. IMI was topically administered to the thorax and the fungus was

administered by contact of the ants with a filter paper impregnated with a conidial

suspension. All ants were acclimatized for one hour before receiving their respective

treatments that lasted four hours. In exp 1 the treatments were: IMI10 (10 ng/kg)

IMI20, IMI40, fungal suspension (F), IMI10+F; IMI20 + F and IMI40 + F. In exp 2, one

ant was treated with F and then placed together with 10 control ants (forming the

group 10CONT+1F) or with 10 ants treated with IMI10 (forming the group 10IMI+1F).

The behaviors were recorded and processed by ANOVA for repeated measurements

and the differences were verified using Duncan’s test. For exp1, results showed that

groups with statistical significance were IMI10, IMI10 + F and F. The IMI10 group

showed higher locomotor activity and reduced self-grooming when compared to

controls and the IMI20 and IMI40 groups. The same was observed for IMI10 + F, but

when compared to control and IMI20+ F or IMI40 + F groups. However, the F group

xii

showed lower locomotor activity and exacerbation of self-grooming when compared

to controls. For exp2, results showed that the presence of ants treated with F

inhibited the agonistic actions and exacerbated allogrooming and antennal contact of

control ants (10CONT+1F). However, changing the experimental design from 10

CONT to 10IMI (10IMI+1F group) resulted in reversal of behaviors, in other words,

exacerbation of aggression and a reduction of allogrooming and antennal contact

time of the ants exposed to the fungus placed together with 10 ants treated with IMI

(10IMI+1F). Therefore, IMI blocked the behaviors produced by fungus in individually

observed ants and changed the social interaction pattern of infected ants, observed

in a group situation. This suggests that IMI could be a useful tool in the control of

leaf-cutting ants.

Keywords: Acromyrmex subterraneus subterraneus, imidacloprid, Beauveria

bassiana, locomotor activity, grooming behaviors, social interaction and biological

control.

1

I - INTRODUÇÃO

1.1 – As formigas cortadeiras

As formigas cortadeiras são importantes componentes dos ecossistemas

tropicais, pois estão envolvidas nos processos de ciclagem de minerais, revolvimento e

aeração do solo. Por outro lado, são consideradas pragas de grande importância na

região Tropical, pois Wheeler em 1913, destacava as formigas cortadeiras como os

insetos-praga mais sérios da região Neotropical. Elas representam um dos problemas

fitossanitários mais graves no Brasil, podendo causar prejuízos em áreas agrícolas e

florestais (Moreira & Tonhasca Jr., 1998).

Os prejuízos diretos causados pelas formigas cortadeiras são aumentados

devido ao fato de que esses insetos têm preferência por plantas jovens, que são mais

vulneráveis à desfolha. Como conseqüência do corte intenso da cobertura vegetal, além

de poderem dizimar plantios agrícolas e florestais, elas também favorecem o

aparecimento de plantas daninhas e o processo de erosão (Moreira & Tonhasca Jr.,

1998). Quanto aos prejuízos indiretos, seus ninhos podem causar danos à construção

civil e estradas, além de causarem perturbações em solos de florestas tropicais

(Garrettson et al., 1998). Quando em grande número, as formigas cortadeiras podem

ainda dificultar o cultivo e o acesso de máquinas em áreas de grandes plantações,

como o da cana-de-açúcar (Guagliumi, 1972). Além disso, suas infestações favorecem

2

o aumento do uso, muitas vezes indiscriminado, de grandes quantidades de inseticidas,

causando prejuízos não só econômicos como principalmente ambientais.

As formigas cortadeiras são herbívoros de grande sucesso evolutivo, sendo

capazes de utilizar uma grande variedade de plantas como alimento; em uma floresta

tropical, cerca de 50 a 70% das espécies vegetais podem ser atacadas por estes

insetos, que consomem entre 12 e 17% da produção total de folhas de uma floresta

(Cherrett, 1986; Höldobler e Wilson, 1990). Entretanto, apesar de serem consideradas

polífagas, elas têm preferências específicas, dependentes, em parte, das características

físicas e químicas da vegetação (Moreira e Tonhasca Jr., 1998). De modo geral há

certa seletividade das fontes alimentares, dependendo do ambiente, época do ano e

espécie de formiga. As principais plantas cultivadas atacadas por essas formigas são:

cana-de-açúcar, cacau, milho, arroz, mandioca, algodão, café, plantas ornamentais e

frutíferas (citros e goiabeira), eucalipto e pastagens (Moreira e Tonhasca Jr. 1998).

Vale lembrar que as formigas são numerosas em quantidade e variedade.

Atualmente, há um total de 574 gêneros e 21.847 espécies de formigas identificadas

(Carbonell et al., 2004). Dentre os diversos gêneros de formigas, existem 12 compondo

a tribo Attini (Subfamília Myrmicinae). Três destes gêneros (Trachymyrmex,

Acromyrmex e Atta) cultivam seus fungos essencialmente com material vegetal fresco

(Fowler et al., 1993; Carbonell et al., 2004), enquanto os outros gêneros utilizam

material vegetal e animal em decomposição como substrato para o desenvolvimento do

fungo simbionte. As formigas Acromyrmex e Atta, também chamadas de formigas

cortadeiras, têm hábito, basicamente, de cortar e carregar folhas, flores e sementes

para o interior dos ninhos subterrâneos. Embora existam diversos grupos de animais

alimentando-se de material vegetal (incluindo mamíferos, homópteros e lepidópteros),

ambos os gêneros são considerados os herbívoros dominantes da região Neotropical

(Hölldobler e Wilson, 1990). As formigas do gênero Atta, conhecidas como as saúvas,

podem ser encontradas desde o sul dos Estados Unidos até o Centro da Argentina e as

quenquéns (gênero Acromyrmex) distribuem-se da Califórnia até a Patagônia,

passando pela América Central, Cuba, Trinidad e América do Sul. Entretanto, nenhuma

dessas formigas são encontradas no Chile (Della Lucia et al., 1993a).

3

1.1.1 – Divisão de trabalho

Quando o formigueiro é estabelecido são formadas as castas permanentes,

constituídas por uma casta reprodutiva (rainha) e outra casta estéril (operárias). As

operárias são divididas em sub-castas (ou castas) de acordo com o trabalho ou a

função que desempenham na colônia (polietismo). Geralmente as castas possuem uma

diferenciação no padrão morfométrico que é chamado de polimorfismo. As formas

aladas de machos e fêmeas constituem as castas temporárias do formigueiro (Della

Lucia et al., 1993b).

Forti et al. (2004) descrevendo polietismo em Acromyrmex subterraneus

brunneus, subdividiram as operárias dessa espécie em quatro subcastas conforme o

tamanho da cápsula cefálica dos indivíduos. As medidas das cápsulas cefálicas das

castas denominadas Grande (Casta 1), Média (Casta 2), Pequena (Casta 3) e Muito

Pequena (Casta 4) correspondiam respectivamente a 1,7-2,0, 1,2-1,6, 0,9-1,1, e 0,7-0,8

mm de largura. A “Casta Grande” apresentou a maioria das suas atividades

relacionadas ao forrageamento, enquanto a “Casta Muito Pequena” esteve

principalmente envolvida com as práticas de jardinagem do fungo simbionte. Já a

“Casta Média” e a “Casta Pequena” apresentaram características intermediárias entre a

forrageamento e jardinagem (Forti et al., 2004).

1.1.2 – Estratégias de defesa da colônia

As formigas da tribo Attini são raramente encontradas infectadas naturalmente

com fungos entomopatogênicos, apesar de esses fungos terem sido encontrados

próximos aos ninhos (Hughes et al., 2004). Na verdade, os insetos socias deveriam ser

mais suscetíveis à infecções por patógenos devido ao estilo de vida, já que milhares de

indivíduos ocupam o mesmo ninho, que é um ambiente de umidade alta e temperatura

estável. Além disso, a baixa variabilidade genética dos membros da colônia é um fator

que poderia aumentar as possibilidades de rápida dispersão de patógenos.

4

A resistência das formigas à infecção por fungos entomopatogênicos,

provavelmente, deve-se aos comportamentos de defesa (“self-grooming” e “allo-

grooming”) e à produção de compostos antibióticos pelas glândulas meta-torácicas

(Hughes et al. 2002). Entretanto, recentemente, foi relatado o papel de bactérias

simbiontes associadas às colônias de formigas cortadeiras na defesa das mesmas

contra um parasito especializado, Escovopsis (Currie et al., 1999 , 2006). Também tem

sido relatada a presença de uma bactéria (Burkholderia) nos ninhos de A. sexdens com

capacidade de inibir o crescimento de fungos entomopatogênicos (Santos et al., 2003).

Portanto, a combinação de defesas comportamentais e químicos (das próprias formigas

e seus microrganismos simbiontes) reduzirá as probabilidades de infecções

generalizadas.

O comportamento de “grooming” remove os conídios de fungos do tegumento

das formigas antes que o fungo possa ter uma chance de infectar o individuo. Os

conídios se acumulam na câmara infrabucal, onde sofrem um processo de

compactação e, possivelmente, são inviabilizados pela secreção de compostos

antifúngicos (Diehl-Fleig e Lucchese, 1991; Oi e Pereira, 1993; Jaccoud et al., 1999).

Subseqüentemente, os “pellets” são regurgitados e depositados na área de lixo da

colônia. Outras estratégias de prevenção de ocorrência de doenças nos ninhos são as

remoções de formigas doentes, fechamento de túneis e alocação dos ninhos por

completo (Roy et al., 2006).

1.1.3 – Sistemas de defesa de formigas cortadeiras

a) Comportamental

a.1) Tratamento do material vegetal

A manipulação do material vegetal pelas formigas, além de preparar o substrato

para o fungo simbionte, auxilia na remoção de possíveis microrganismos, como

bactérias, esporos de fungos e outros microrganismos patogênicos. A retirada da

camada de cera das folhas é um processo que auxilia na eliminação de alguns intrusos.

5

Tanto em Atta sexdens quanto em Acromyrmex subterraneus a ação mais freqüente no

preparo do material vegetal é o lambedura deste, seguido da atividade de morder ou

preguear as bordas da superfície das folhas; geralmente tais tarefas são

desempenhadas pelas jardineiras (Cherrett, 1980; Höldobler e Wilson, 1990; Andrade e

Forti, 2001).

a.2) Cuidados com o jardim de fungo

Existem evidências indicando que o jardim do fungo simbionte não é um cultivo

puro, podendo existir outros fungos convivendo junto ao simbionte. Currie et al. (1999) e

Rodrigues et al. (2005) verificaram que a remoção de formigas jardineiras causou

excessivo crescimento de outros tipos de fungos. Dados da literatura revelam que o

jardim de fungo é freqüentemente contaminado por outros tipos de fungo, o que pode

comprometer a saúde do fungo simbionte (Currie et al., 1999). Como estratégia

comportamental, as formigas fazem extensivas atividades de lambedura do fungo

(“fungus grooming”) e também removem partes deste, com a finalidade de preservar o

seu simbionte (Currie e Stuart, 2001).

a.3) Comportamento de limpeza

As formigas apresentam muitas adaptações comportamentais, tais como limpeza

do corpo, higiene do ninho, remoção de cadáveres (necroforese) e de indivíduos

doentes, o que impede a disseminação de doenças pela colônia (Diehl-Fleig, 1995).

Wilson e Regnier (1971) descreveram o processo de limpeza como uma atividade

envolvendo o uso de pentes tibiais, fricção de patas e lambidas para manter a

superfície do corpo limpa. Elas podem se limpar (auto-limpeza) ou umas as outras

(limpeza coletiva).

Estes insetos removem esporos de fungos entomopatogênicos de suas cutículas

por meio de lambimentos e armazenamento em “pellets” na câmara infrabucal, onde

6

são cobertos por secreções quitinolíticas. Esses “pellets” podem ser descartados na

lixeira do formigueiro (Diehl-Fleig e Lucchese, 1991; Oi e Pereira, 1993).

b) Químico

Além da limpeza, as formigas contam com agentes químicos, antimicrobianos,

para combater seus patógenos. Dados da literatura mostram que elas conseguem

produzir, com suas glândulas, componentes químicos com propriedades bactericidas,

fungistáticas e/ou fungicidas (Diehl-Fleig, 1995). Brough (1983) verificou que a glândula

mandibular de Calomyrmex sp., além das funções de alarme e repelente para

vertebrados e outros insetos, também age como antimicrobiano. Beattie et al. (1986)

realizaram testes com esporos de fungos de solo e entomopatogênicos e puderam

encontrar efeitos inibitórios mais acentuados nos entomopatogênicos Beauveria

bassiana e Paecilomyces lilacinus.

Por outro lado, Diehl-Fleig (1995) com base em seus resultados infere que a

secreção metapleural não possui efeito antisséptico, o qual nos casos em que foi

detectado apresentou curta duração, sugerindo apenas ação fungistática. Assim, as

glândulas metapleurais não parecem fornecer uma barreira contra microrganismos

patogênicos. Contudo, a mesma autora não desconsidera a possibilidade de uma ação

conjunta com outras glândulas, cujos produtos tenham efeitos antibióticos.

1.1.4 – Controle químico de formigas

Atualmente, o controle químico é a forma mais utilizada no controle das formigas

cortadeiras. Dentre os métodos químicos mais usados estão às iscas granuladas, a

termonebulização e os pós (Moreira & Tonhasca Jr., 1998).

As iscas granuladas, como sulfluramida (Mirex-S), têm sido a forma mais

eficiente, econômica e prática, em relação aos demais métodos químicos para o

controle destes insetos até o momento, desde que aplicados corretamente (Cherrett &

7

Peregrine, 1976; Lofgren, 1986; Della Lucia & Vilela, 1993). As substâncias atrativas

presentes nessas iscas fazem com que os grânulos sejam coletados pelas formigas e

transportados para o interior do ninho, onde são incorporados ao fungo. Como essas

iscas contêm um inseticida de baixa concentração, a intoxicação das formigas ocorre

durante o transporte do produto, quando elas o fragmentam, quando se alimentam do

fungo ou quando trocam alimento entre si. Eventualmente, essas circunstâncias

atingirão a rainha, o que significará na morte da colônia (Moreira & Tonhasca Jr., 1998).

Porém, o uso de iscas possui algumas restrições, como prejuízos a espécies não alvo,

amuamento e rejeição (Mariconi, 1970; Juruena, 1984).

A termonebulização é um método que tem um alto custo no que se refere à

aquisição, manutenção e operação do equipamento, o termonebulizador, o qual é uma

adaptação de um pulverizador costal motorizado. O método em si consiste em

introduzir, nos olheiros, gotículas de inseticida transportadas pela fumaça gerada pelo

termonebulizador. A fumaça resulta do aquecimento de um inseticida líquido que é

misturado a óleo diesel ou mineral. Esta forma de controle é altamente eficaz para

todas as espécies, pois mata as formigas por contato e ingestão do formicida,

ocorrendo efeito imediato (Moreira & Tonhasca Jr., 1998).

Os formicidas pós são constituídos basicamente de um princípio ativo com ação

de contato, um talco como inerte e um veículo de aplicação. A aplicação é feita através

de polvilhadeiras, equipamentos manuais dotados de um recipiente cônico para

acondicionamento do produto. As primeiras formulações continham princípios ativos

clorados, frequentemente o aldrim e o heptacloro, atualmente proibidos. Os produtos

dos grupos dos fosforados, carbamatos e piretróides também já foram testados na

formulação pó. Juruena (1984), utilizou os inseticidas malatiom 4%, paratiom 1,5%,

fentiom 5%, triclorfom 2,5% e bendiocarbe 1%, para controle de Acromyrmex lobicornis,

A. heyeri e A. striatus, constatando a extinção de formigueiros 10 dias após a aplicação.

Delabie (1989) constatou eficiência satisfatória (90 a 100%) dos produtos fentiom,

deltametrina e fenitrotiom, para controle de Acromyrmex subterraneus brunneus, com

porcentagens de 50 a 70% de eficiência para Atta sexdes sexdens. Recentemente, o

produto K-Othrine 2P, inseticida piretróide à base de deltametrina 0,2%, tem sido

indicado para controle de saúvas e quenquéns, na dosagem de 10g do produto

8

comercial por m2 de formigueiro. Trabalhos realizados por Bendeck et al. (1995 a e b),

indicaram eficiência de 100% do produto no controle de A. sexdens rubropilosa, nas

dosagens de 10, 30, 50 e 75 g de p.c./ m2 de formigueiro, e de Acromyrmex crassipinus

nas dosagens de 10 e 20 g/m2.

1.2 – O uso de fungos entomopatogênicos em controle biológico

Segundo DeBach (1974), o controle biológico de insetos-pragas com uso de

microrganismos é bastante específico, de baixo custo e inócuo ao ecossistema. Além

das vantagens citadas acima, o controle com fungos entomopatogênicos não apresenta

um único mecanismo de infecção ao hospedeiro, diferenciando-se das bactérias e vírus

(Charnley, 1997). Segundo Tabashnik (1994), não foram observados casos de

resistência contra fungos entomopatogênicos.

1.2.1 – O uso de Beauveria bassiana no controle de pragas.

O fungo Beauveria bassiana pertence à classe Ascomycotina e é considerado

um entomopatógeno de importância significativa para o controle de insetos pragas

(Alves, 1986). Os fungos entomopatogênicos completam seu ciclo de infecção nos seus

hospedeiros em 6 etapas: adesão, germinação, penetração, colonização, reprodução e

disseminação. Após a adesão no tegumento do inseto, a germinação ocorre no mínimo

em 12 horas com uma temperatura entre 23 e 30 ºC e umidade relativa acima de 90%

(Alves, 1986). O gênero Beauveria consegue germinar sobre qualquer parte do corpo

do hospedeiro (Pekrul e Grula, 1979). Na penetração existem os processos físicos e

químicos auxiliando o patógeno, em que no físico a pressão das hifas é responsável por

romper as áreas mais membranosas, já no químico, enzimas do tipo proteases, lípases

e quitinases se incumbem de facilitar a penetração, degradando o tegumento (Alves,

1986). A penetração então é sucedida pela colonização do fungo, que pode variar de 76

a 120 horas, dependendo do inseto e das condições ambientais (Pekrul e Grula, 1979).

9

Após a morte do hospedeiro, o fungo difunde-se para todo o corpo do inseto, sendo que

na maioria dos casos, o hospedeiro torna-se mumificado, pois provavelmente a

decomposição bacteriana é impedida devido à produção de antibióticos pelo fungo

(Ferron, 1978). Cerca de 4 ou 5 dias após a infecção inicial as hifas começam a surgir

através dos espiráculo e após 24 horas (ou até 48 horas) da emergência das hifas

inicia-se a conidiogênese, a qual depende de altas temperaturas (20 a 30ºC) e umidade

(Ferron, 1978). A partir daí, pode ocorrer à disseminação na forma de esporos.

1.2.2 – O uso de fungos entomopatogênicos para o controle de formigas

Curiosamente, foi relatada a presença de fungo, B. bassiana, num fóssil de 25

milhões de anos de uma formiga (Poinar e Thomas, 1984). Trabalhos citados por

Pereira (1996) descrevem a existência de fungos entomopatogênicos em diferentes

populações de formigas. Alguns trabalhos (Pereira, 1996; Pereira e Stimac, 1997)

sugerem que os fungos entomopatogênicos são fortes candidatos para o controle

biológico de formigas. O interesse neste tipo de controle biológico vem cada vez mais

aumentando, devido à busca por novas alternativas de controle e a necessidade de

minimizar a adição de substâncias químicas no ambiente (Pereira e Stimac, 1997).

Fungos entomopatogênicos poderiam ser desenvolvidos para o controle de

formigas, pois já se demonstrou a capacidade destes em destruir colônias em pouco

tempo. Além de serem aplicados com equipamentos de uso comuns e das condições

dos ninhos serem propícias ao seu desenvolvimento (Diehl-Fleig et al., 1992a; Stimac et

al., 1987).

10

1.3 – Imidaclopride ( IMI)

O imidaclopride [1-(6-cloro-3-piridilmetil)-2-nitroimino-imidazolidina] é um

inseticida sintetizado por processos químicos e atualmente possui vasta utilização no

controle de pragas. Seu mecanismo de ação está relacionado com a ativação dos

receptores da acetilcolina do tipo nicotínico sendo, por isso, classificado como

neonicotinóide, com especificidade para receptores nicotínicos de invertebrados

(Matsuda et al., 2001). Assim, como outros agonistas nicotínicos, como a nicotina, o IMI

produz alterações comportamentais em insetos principalmente relacionado ao

comportamento locomotor. Nesse sentido, ele atua na locomoção de forma dose-

dependente, ou seja, quando utilizado em doses baixas produz aumento da locomoção;

quando utilizado em doses elevadas, produz diminuição da atividade locomotora

(Bainton et al., 2000; Lambin et al., 2001).

1.3.1 – Acetilcolina.

A acetilcolina é um neurotransmissor excitatório do sistema nervoso de

vertebrados e de invertebrados (Millar et al., 2007). Seus efeitos foram verificados pela

primeira vez por Dale em 1869, o qual verificou que a muscarina imitava os efeitos do

nervo vago, enquanto a atropina inibia a estimulação nervosa e a produzida pela

muscarina. Similarmente, Langley em 1905 demonstrou que a nicotina e o curare

produziam na junção neuromuscular estimulação e inibição, respectivamente (Rang et

al., 2001). Enquanto a transmissão neuromuscular de vertebrados e vários

invertebrados é mediada pela acetilcolina, em insetos tal efeito é produzido pelo

glutamato (Unsherwood, 1994). Os efeitos da acetilcolina e do glutamato não diferem

somente em nível de junção sináptica, ao passo que no cérebro de mamíferos o

glutamato é o principal neurotransmissor excitatório, ao contrário dos insetos que têm a

acetilcolina assumindo esta função, principal neuromodulador excitatório em insetos

(vide Millar et al., 2007).

Para que a acetilcolina possa exercer seus efeitos é necessário que esta seja

liberada pré-sinapticamente por exocitose, atravesse a fenda sináptica e alcance um

11

dos seus receptores pós-sinapticamente (a acetilcolina também se liga a receptores

pré-sinápticos, de modo que nem toda ela atravessa a fenda sináptica). Tal processo

tanto para a acetilcolina quanto para qualquer outro neurotransmissor é chamado de

neurotransmissão (Rang et al., 2001).

Os receptores farmacológicos da acetilcolina se dividem em dois grupos devido à

afinidade à nicotina ou a muscarína, sendo os receptores nicotínicos e muscarínicos,

respectivamente (Rang et al., 2001). Os receptores nicotínicos são membros da família

de canais iônicos com sítio para ligantes (Millar, 2006), já os muscarínicos são

receptores acoplados a proteínas G (Bockaert, 2001). Nos insetos, os receptores

nicotínicos são os mais abundantes dentre os excitatórios pós-sinápticos (Sattelle,

1980). Tanto é que o tecido do sistema nervoso de insetos constitui uma rica fonte

destes receptores (Dudai, 1978; Breer e Sattelle, 1987).

1.3.2 – Receptor Nicotínico.

Os receptores nicotínicos são complexos pentâmeros da superfície celular,

contendo 5 subunidades protéicas unidas entre si (Millar et al., 2007). Segundo a

revisão de Thany e colaboradores (2006) as subunidades de receptores nicotínicos de

insetos, assim como de vertebrados, consiste de um amplo domínio n-terminal

extracelular envolvido na ligação agonística, seguido por 3 regiões transmembrana

(TM1, TM2 e TM3, com TM2 revestindo), um largo loop extracelular, um quarto domínio

transmembrana (TM4) e uma região c-terminal extracelular.

Os receptores nicotínicos não possuem exatamente o mesmo arquétipo

molecular ao longo dos reinos, ou até mesmo das espécies. De forma que em todas as

espécies avaliadas verifica-se uma variedade subunidades, que podem se unir em

diversos arranjos para formar distintas populações de receptores nicotínicos. Esta

diversidade de subunidades entre as espécies é considerada a responsável pela larga

diversidade funcional e farmacológica dos receptores nicotínicos (Le Novere et al.,

2002; Millar, 2003). Foram realizados estudos com 6 nitrometilenos em diferentes

linhagens celulares. Embora potentes ações agonistas e antagonistas fossem

12

observadas em neurônios de gafanhotos, os nitrometilenos atuaram somente com uma

fraca ação antagonista sobre receptores de mamíferos, sendo que nenhum efeito

agonista foi observado. Estudos comparativos mostram que o imidaclopride e

nitrometilenos têm baixa afinidade para vários receptores nicotínicos de mamíferos

(Ihara et al., 2003 e 2004).

1.4 – A combinação de fungos entomopatogênicos com o inseticida imidaclopride

O sofisticado sistema de organização da colônia tem sido um obstáculo para os

trabalhos de controle biológico, já que interações sociais complexas favorecem a

manutenção do equilíbrio do ninho (Höldobler e Wilson, 1990). Em vários insetos,

comportamentos como exposição ao sol, lambedura (grooming) e outras interações

sociais promovem a defesa contra microrganismos. Os melhores exemplos de

estratégias comportamentais de defesa são observados nas formigas e nas abelhas, as

quais apresentam um extensivo comportamento de limpeza de seus corpos, limpeza de

ninho e produção de compostos defensivos (Boucias et al., 1996).

Um dos motivos da falta de sucesso no controle biológico com fungos é a

existência de estratégias comportamentais, que resultam na redução da incidência de

infecções (Jaccoud et al., 1999). Segundo Evans (1982) as formigas assumem algumas

posturas comportamentais, tais como higienização do ninho e de retirada de cadáveres

infectados, que dificultam a infecção entomopatogênica na colônia. Para Oi e Pereira

(1993) o simples fato de se evitar o inoculo é um ato comportamental que dificulta a

disseminação de doenças pela colônia.

Segundo Pereira (1996), a associação de patógenos com alguns mecanismos

que interfiram no comportamento normal da colônia pode ser de grande importância no

controle microbiano destes insetos. Alguns destes produtos fitossanitários afetam o

comportamento dos insetos, favorecendo a utilização de um controle acoplado a

entomopatógenos. Estudos recentes evidenciam as vantagens da utilização do

inseticida imidaclopride em doses sub-letais, concomitante com fungos

entomopatogênicos, para o controle de diferentes espécies de cupins, nos quais a

13

colônia se mantém livre de patógenos graças à capacidade de defesa dos indivíduos.

Este inseticida em baixas concentrações causa interferências no comportamento social

de cupins, tal como trofalaxia, grooming e construção de túneis (Boucias et al., 1996;

Almeida et al., 1997; Moino Jr. e Alves, 1998). Estudos ainda têm mostrado que o

inseticida imidaclopride não interfere significativamente na germinação nem no

crescimento vegetativo dos fungos B. bassiana e M. anisopliae (Boucias et al., 1996).

Santos et al. (2007) mostraram em testes de laboratório que doses sub-letais de

imidaclopride aumentavam a suscetibilidade de formigas a infecção com

entomopatógenos, de modo que a porcentagem de mortalidade de insetos tratados com

o fungo Beauveria bassiana CG24 + IMI foi de aproximadamente 20% mais alta do que

de formigas tratadas apenas com o fungo.

1.5 – Hipóteses

Diante de todos os dados levantados e especialmente das evidências que

apontam para a possibilidade de inseticidas neonicotinóides auxiliarem no controle

biológico alterando as características comportamentais das formigas cortadeiras, este

trabalho formulou as seguintes hipóteses: 1) O imidaclopride é capaz de alterar os

comportamentos de formigas cortadeiras; 2) A presença de esporos de Beauveria

bassiana desencadeia principalmente um aumento dos comportamentos de defesa,

tanto o individual (auto-limpeza) quanto o coletivo (limpeza coletiva); 3) O imidaclopride

pode influenciar a reação comportamental induzida pela presença de esporos de B.

bassiana.

14

II – OBJETIVOS

2.1 – Objetivo geral

• Avaliar o efeito do imidaclopride e da suspensão conidial do fungo Beauveria

bassiana sobre os comportamentos de auto-limpeza, locomoção, limpeza

coletiva, antenação e comportamentos agonísticos da formiga Acromyrmex

subterraneus subterraneus.

2.2 – Objetivos específicos

• Selecionar uma dose eficaz de imidaclopride que atue sobre a auto-limpeza e a

locomoção de formigas que foram testadas individualmente.

• Verificar o efeito do fungo B. bassiana no comportamento de auto-limpeza e de

locomoção de formigas A. s. subterraneus.

• Verificar a capacidade do imidaclopride em reverter o efeito do fungo B. bassiana

nos comportamentos de locomoção e auto-limpeza de formigas A. s.

subterraneus.

• Verificar o efeito da solução do fungo B. bassiana sobre os comportamentos de

limpeza coletiva, de antenação e agonísticos de formigas A. s. subterraneus.

• Verificar se o imidaclopride é capaz de reverter os comportamentos sociais

induzidos pelo contato com o fungo.

15

III – MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – Insetos

Foram utilizadas formigas operárias do tamanho máximo (cápsula cefálica

medindo de 1,7 a 2,0 cm) da subespécie Acromyrmex subterraneus subterraneus,

provenientes de três ninhos coletados em Viçosa e mantidos em laboratório (Unidade

de Mirmecologia – Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias – Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro). Todos os tratamentos deste trabalho

consistiram de um número igual de indivíduos oriundos de cada um dos ninhos. As

formigas foram supridas somente com as folhas da planta Acalifa sp., e mantidas em

ninhos artificiais, os quais possuíam compartimentos como câmaras de cultivo do fungo

simbionte, de lixo e área de forrageamento. No fundo das câmaras, onde o fungo

simbionte era cultivado, possuía uma camada de gesso de aproximadamente 1 cm de

profundidade e na tampa destas câmaras havia um orifício (3 cm de diâmetro) tampado

com algodão, diariamente umedecido para manter uma alta umidade dentro do ninho.

As colônias foram mantidas em uma sala à temperatura de 25+2ºC, umidade relativa de

80% e foto período de 12 horas claro e 12 horas escuro. Os testes comportamentais

foram conduzidos na fase clara no período das 13:00 às 17:00 horas. Todos os

cuidados referentes à criação e manejo das formigas seguiram as recomendações de

Della Lucia et al. 1993c.

16

3.2 – Inseticida

Utilizou-se o agonista nicotínico, imidaclopride - IMI (Confidor®; 70% de

imidaclopride e 30% de inertes – Bayer do Brasil) nas doses de 10, 20 e 40 ng/inseto. O

inseticida foi diluído em água destilada estéril e administrado topicamente em um

volume de 1µl no tórax das formigas com o auxílio de uma micropipeta.

3.3 – Fungo entomopatogênico

Foi utilizado o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana (isolado denominado

CG24), obtido do Centro Nacional de Recursos Genéticos (CENARGEN). O isolado do

fungo foi repicado em Agar Sabouraud Dextrose (20g dextrose, 2,5g de peptose, 5g de

extrato de levedura e 20g de agar diluído em 1 litro de água destilada estéril) e mantido

em estufa com temperatura de 26ºC durante um período de 15 dias.

Após 15 dias obteve-se a suspensão conidial, em Tween 80 a 0,05 %, a uma

concentração de 1 x 108 conídios/ml. Tal concentração foi calculada a partir do Manual

de Técnicas em Patologia de Insetos (Lacey, 1997). Em todos os experimentos, os

conídios foram disponibilizados para as formigas em discos de papel filtro (6 cm de

diâmetro), previamente imersos na suspensão conidial. As formigas mantiveram contato

com o fungo por um período de 4 horas.

3.4 – Testes

Os Testes Comportamentais foram realizados numa sala do Setor de

Farmacologia (LSA/CCTA/UENF) com temperatura de 25 + 2ºC e umidade de

aproximadamente 60%. Placas de Petri de acrílico (10 cm de diâmetro e 1,5 cm de

altura) foram utilizadas como arena experimental.

17

Experimento 1

FORMIGUEIRO As formigas foram retiradas da área de forrageamento do ninho, foram colocadas em placas de petri individuais e levadas ao Setor de Farmacologia.

PERÍODO DE ACLIMATAÇÃO

No Setor de Farmacologia, as formigas ficaram por 1 hora nas placas onde não foram submetidas a nenhum tipo de manipulação.

TRATAMENTO FARMACOLÓGICO

Após a aclimatação, cada formiga recebeu seu tratamento e permaneceu na placa por 4 horas.

TESTES COMPORTAMENTAIS Após o tratamento, cada formiga foi colocada em uma arena experimental e teve início o registro comportamental por 10 minutos.

REGISTRO COMPORTAMENTAL

Dividiu-se a sessão experimental em 2 blocos de 5 min.

Locomoção � utilizou-se o software Ethovision e registrou-se à distância percorrida (cm). Auto-limpeza � registrou-se o tempo (segundos): •Limpeza de uma perna na outra; •Limpeza das pernas anteriores com as partes bucais; •Limpeza das antenas com as partes bucais ou com as pernas anteriores; •Limpeza do abdômen com as partes bucais ou com as pernas posteriores; •Limpeza da cabeça com os tarsos.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

18

Experimento 2

FORMIGUEIRO As formigas foram retiradas da área de forrageamento do ninho, sendo que:

• 10 foram colocadas em uma placa de petri e;

• 1 foi marcada e separada das demais em outra placa.

PERÍODO DE ACLIMATAÇÃO

No Setor de Farmacologia, as formigas ficaram por 1 hora nas placas onde não foram submetidas a nenhum tipo de manipulação.

TRATAMENTO FARMACOLÓGICO

Após a aclimatação, cada formiga recebeu seu tratamento e permaneceu na placa por 4 horas.

TESTES COMPORTAMENTAIS

Após o tratamento, a formiga marcada foi colocada na placa (que serviu de arena experimental) que estavam as 10 formigas do seu mesmo ninho, assim iniciou-se o registro comportamental por 10 minutos.

REGISTRO COMPORTAMENTAL

Dividiu-se a sessão experimental em 2 blocos de 5 min.

Locomoção � a arena experimental foi dividida em 4 quadrantes iguais e foi contabilizado o número de vezes que a formiga marcada passou de um quadrante para o outro. Auto-limpeza � parâmetro do exp. 1. Limpeza coletiva � tempo (seg.) em que uma, ou mais, das formigas companheiras não marcadas lamberam a formiga marcada. Antenação � número de vezes em que uma ou mais das formigas companheiras não marcadas mantiveram contatos antenais com a formiga marcada. Comportamentos agonísticos �� número de vezes em que uma ou mais das formigas companheiras não marcadas emitiram atitudes e posturas de agressão (mordida, abertura de mandíbula e flexionamento do gáster) direcionadas às formigas marcadas.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

19


Beauveria bassiana e da associação sobre o comportamento de limpeza e de

locomoção de A. s. subterraneus.

O presente experimento teve por objetivo verificar os efeitos do imidaclopride, da

suspensão conidial do fungo e da associação IMI+Fungo nos comportamentos de auto-

limpeza e de locomoção de operárias observadas individualizadas.

3.5.1 – Tratamentos

Após o período de aclimatação, as formigas foram divididas nos seguintes

grupos:

1) Imidaclopride (IMI).

• Água – Veículo do IMI (n=24)

• IMI 10 ng/inseto (n=24)



2) Beauveria bassiana (Bb).

• Tween – Veículo do Bb (n=24)

• Bb (n=24)

3) Imidaclopride + Bb.

• Água + Tween (n=24)

• IMI 10 ng/inseto + Bb (n=24)



20

Os tratamentos acima citados assim como os testes comportamentais

aconteceram concomitantemente, ou seja, em cada teste comportamental houveram

três formigas de cada tratamento (cada uma dessas formigas pertencia a um ninho

diferente). Após 8 sessões de testes comportamentais, que aconteceram em dias

diferentes, alcançou-se um número igual a 24 para casa tratamento. Todas as formigas

receberam seus respectivos tratamentos e permaneceram nas suas placas por um

período de 4 horas. Em seguida, foram retiradas de sua placa e colocadas na arena

experimental para o registro comportamental. As formigas foram filmadas na arena

experimental por um período de 10 minutos, posteriormente as imagens foram

analisadas.

3.6 – Experimento 2: Efeito da administração do imi daclopride e do fungo

Beauveria bassiana no comportamento de formigas observadas em grupo

As formigas observadas em grupo foram marcadas com tinta guache branca na

parte posterior do tórax. Foi conduzido um experimento preliminar para verificar se a

tinta utilizada na marcação poderia produzir alterações comportamentais, assim

delineado: formigas veículo marcadas com tinta (veículo-tinta) e formigas com fungo

marcadas com tinta (fungo-tinta). No procedimento experimental do teste preliminar a

formiga foi retirada do seu ninho, imediatamente marcada com tinta guache branca e

colocada em uma placa de Petri, onde se aclimatou por um período de uma hora.

3.6.1 – Tratamentos

Após o período de aclimatação, as formigas foram divididas nos seguintes

tratamentos (para cada tratamento os ensaios foram repetidos 24 vezes, com formigas

diferentes):

21

1) Tratamentos controles

• 10NT-1NT � 10 formigas sem qualquer tipo de tratamento (não tratadas – NT)

receberam em sua placa de Petri (arena experimental) 1 formiga (aquela

marcada e separada das demais) não tratada.

• 10NT-1VeicF � 10 formigas não tratadas receberam em sua placa de Petri 1

formiga tratada com o veículo do fungo.

• 10VeicIMI-1VeicF � 10 formigas tratadas com veículo do IMI receberam em sua

placa de Petri 1 formiga tratada com o veículo do fungo.

2) Tratamentos

• 10NT-1F � 10 formigas não tratadas receberam em sua placa de Petri 1 formiga

tratada com o fungo.

• 10VeicIMI-1F � 10 formigas tratadas com o veículo do IMI receberam em sua

placa de Petri 1 formiga tratada com a suspensão de fungo.

• 10IMI-1F � 10 formigas tratadas com o IMI10 receberam em sua placa de Petri

1 formiga tratada com a suspensão de fungo.

22

IV – RESULTADOS



locomoção de A. s. subterraneus.

Inicialmente, avaliou-se a possibilidade da existência de diferenças significativas

entre as formigas provenientes das três colônias utilizados no experimento com relação

aos comportamentos de locomoção e auto-limpeza. Para isso, utilizou-se a análise de

variância (ANOVA) de um fator (fator ninho), a qual mostrou não haver diferença

significativa entre os três ninhos, tanto para a auto-limpeza [F(2,237) = 0,03; p>0,5] quanto

para a locomoção [F(2,237) = 0,39; p>0,5] (dados não mostrados).

4.1.1 – Tratamento com imidaclopride (IMI)

A média de ocorrência dos comportamentos de auto-limpeza e locomoção

observados após o contato com imidaclopride nas doses de 10, 20 e 40 ng/inseto em

formigas observadas individualmente são apresentadas na Figura 1. Para a auto-

limpeza (Fig. 1A) a análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas mostrou que

houve efeito do fator tratamento [F(3,92)= 4,85; p<0,01] e do fator intervalo [F(1,92)= 21,36;

p<0,01], porém não houve interação intervalo X tratamento [F(3,92)= 2,05; p>0,05]. Os

resultados mostram, segundo o teste de Duncan, que o tratamento IMI-10 apresentou

tempo de auto-limpeza menor que todos os outros tratamentos (p<0,01). No primeiro

23

intervalo (5 primeiros minutos) o tempo de emissão de auto-limpeza (9,67+1,41

segundos (s); média + desvio padrão, respectivamente) foi maior que no segundo

intervalo (5,61+0,73 s) para todos os tratamentos (p<0.05).

Para a locomoção (Fig. 1B) a ANOVA para medidas repetidas mostrou que


p<0,01], mas não houve interação intervalo x tratamento [F(3,92)= 0,61; p>0,05]. Os

resultados mostram, segundo o teste de Duncan, que o tratamento IMI-10 apresentou

maior atividade locomotora que todos os outros tratamentos (p<0,01). No primeiro

intervalo, a locomoção (496,28+23,84 cm) foi menor que no segundo intervalo

(570,59+26,47 cm). Isso também foi o caso para os outros três tratamentos (p<0.05).

Figura 1: Quantificação dos comportamentos de auto-limpeza (A) e de locomoção (B) produzidos pela administração de imidaclopride (média e Erro Padrão da Média). + indica que o tratamento IMI10 apresentou tempo de auto-limpeza menor que todos os tratamentos. * indica que o tratamento IMI10 apresentou locomoção maior do que os outros tratamentos (ANOVA seguida do teste de Duncan; p<0,05).

AU

TO

-LIM

PE

ZA

(s)

0

10

20

40

60

80

INTERVALOS SUCESSIVOS DE 5 MIN1 2

LOC

OM

OÇ

ÃO

(cm

)

0

200

400

600

800

VeículoIMI 10IMI 20IMI 40

INTERVALOS SUCESSIVOS DE 5 MIN12

A B

+

*

24

4.1.2 – Tratamento com fungo

A quantificação dos comportamentos de auto-limpeza e locomoção observados

após o contato com a suspensão de fungo em formigas observadas individualmente

são apresentadas na Figura 2. Para a auto-limpeza (Fig. 2A), a ANOVA para medidas

repetidas mostrou que houve interação intervalo x tratamento [F(1,46)= 12,89; p<0,01],

houve efeito do fator tratamento [F(1,46)= 83,71; p<0,01] e do fator intervalo [F(1,46)=

31,01; p<0,01]. Para analisar a interação intervalo X tratamento, utilizou-se a ANOVA

de um fator seguida do teste de comparações múltiplas de Duncan, onde se verificou o

efeito dos tratamentos em cada intervalo. Os resultados mostraram que as formigas que

mantiveram contato com o fungo apresentaram um tempo de auto-limpeza maior do

que aquelas que tiveram contato apenas com o veículo usado na suspensão do fungo

(p<0,05).

Para a locomoção (Fig. 2B), a ANOVA para medidas repetidas mostrou que


p<0,01], mas não houve interação intervalo x tratamento [F(1,46)= 1,65; p>0,05]. O

tratamento com fungo apresentou menor atividade locomotora que o tratamento veículo

(p<0,05) e a locomoção do primeiro intervalo (356,08+14,54 cm) foi menor que a

locomoção do segundo intervalo (514,65+38,29 cm) para todos os tratamentos

(p<0,05).

25

Figura 2: Quantificação dos comportamentos de auto-limpeza (A) e de locomoção (B) produzidos após o contato com o fungo B. bassiana (média e erro padrão da média). * indica que o tratamento fungo apresentou maior tempo de auto-limpeza em relação ao seu veículo em ambos os intervalos. + indica que o tratamento fungo apresentou menor locomoção em relação ao seu veículo (ANOVA seguida do Teste de Duncan; p<0,05).

4.1.3 – Tratamento com IMI + fungo


observados após a associação com imidaclopride e a suspensão de fungo em formigas

observadas individualmente são apresentadas na Figura 3. Para a auto-limpeza (Fig.

3A), a análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas mostrou que houve efeito

do fator tratamento [F(3,92)= 9,70; p<0,01] e do fator intervalo [F(1,92)= 11,28; p<0,01],

mas não houve interação intervalo x tratamento [F(3,92)= 0,56; p>0,05]. Os resultados

mostraram, por meio do Teste de Duncan, que o tratamento IMI-10+F (imidaclopride 10

+ fungo) apresentou tempo de auto-limpeza menor que todos os outros tratamentos

(p<0,05). Os tratamentos IMI-20+F e IMI-40+F apresentaram tempo de auto-limpeza

maior que o tratamento veiculo (p<0,05). No primeiro intervalo o tempo de auto-limpeza

(12,38+1,38 s) foi maior que no segundo intervalo (7,18+1,09 s; p<0,05).

AU

TO

-LIM

PE

ZA

(s)

0

20

40

60

80

LOC

OM

OÇ

ÃO

(cm

)

0

200

400

600

800

VeículoFungo

INTERVALOS SUCESSIVOS DE 5 MIN

1 2


1 2

*+

A B

*

26

Para a locomoção (Fig. 3B), a ANOVA para medidas repetidas mostrou que


p<0,01], mas não houve interação intervalo x tratamento [F(3,92)= 0,18; p>0,05]. Os

resultados mostraram, por meio do Teste de Duncan, que o tratamento IMI-10+F

apresentou locomoção maior que todos os outros tratamentos e o IMI-40+F apresentou

locomoção menor que os tratamentos veículo, IMI-20+F e IMI-40+F (p<0,05). Não

houve diferenças entre o IMI-20+F e o IMI-40+F (p>0,05). No primeiro intervalo, a

locomoção (363,04+17,37 cm) foi menor que no segundo intervalo (461,11+28,26 cm)

para todos os tratamentos (p<0,05).

Figura 3: Quantificação dos comportamentos de auto-limpeza (A) e de locomoção (B) produzidos pela administração de imidaclopride+fungo B. bassiana (média e erro padrão da média). + indica atividade comportamental menor que todos os tratamentos. * indica atividade comportamental maior de todos os tratamentos. ++ indica a segunda menor atividade comportamental (ANOVA seguida do teste de Duncan; p<0,05).


AU

TO

-LIM

PE

ZA

(s)

0

10

20

40

60

80


LOC

OM

OÇ

ÃO

(cm

)

0

200

400

600

800

Veículo IMI+FIMI 10 + FIMI 20 + FIMI 40 + F

1 2 1 2

A B

+++

*

+

27

4.1.4 – Comparação entre os efeitos da aplicação de somente IMI e de IMI + fungo

sobre o comportamento locomotor e de auto-limpeza de formigas


observados após o contato ora com o IMI 10 ora com o IMI 10 + a suspensão de fungo

em formigas observadas individualmente são apresentadas na Figura 4. Escolheu-se a

concentração de IMI 10 ng/inseto porque ela produziu efeitos comportamentais opostos

aos produzidos pelo fungo, ou seja, diminuição da auto-limpeza e aumento da

locomoção. Quanto à auto-limpeza (Fig. 4A), os resultados mostraram que houve

interação intervalo x tratamento [F(3,140)= 20,61; p<0,01], houve efeito do fator

tratamento [F(3,140)= 111,37; p<0,01] e do fator intervalo [F(1,140)= 60,08; p<0,01]. Na

análise da interação intervalo X tratamento, os resultados mostraram que tanto no

primeiro quanto no segundo intervalo, o tratamento IMI-10 e o tratamento IMI-10+F

apresentaram tempo de auto-limpeza menor que os tratamentos controle e fungo

(p<0,05). O tratamento fungo apresentou o maior tempo de auto-limpeza quando

comparado a todos os outros tratamentos (p<0,05).

Para a locomoção (Fig. 4B), os resultados mostraram que houve efeito do fator

tratamento [F(3,140)= 15,93; p<0,01] e do fator intervalo [F(1,140)= 21,35; p<0,01], porém

não houve interação intervalo x tratamento [F(3,140)= 1,65; p>0,05]. Os resultados

mostram que o tratamento IMI-10 apresentou locomoção maior que todos os outros

tratamentos (p<0,05) e o tratamento fungo apresentou locomoção menor que todos os

demais tratamentos (p<0,05). Os tratamentos veículo e IMI10+F não diferiram entre si

apresentando locomoção menor que o tratamento IMI-10, porém maior que o

tratamento fungo (p<0,05). Os resultados também mostraram que houve aumento da

atividade locomotora no decorrer do teste, ou seja, a atividade locomotora foi menor no

primeiro intervalo para todos os tratamentos experimentais (p<0,05).

28

Figura 4: Quantificação dos comportamentos de auto-limpeza (A) e de locomoção (B) provenientes da comparação entre os tratamentos IMI-10, Fungo e IMI-10+F (média e erro padrão da média). *indica maior atividade comportamental dentro de cada intervalo. + indica menor atividade comportamental em de cada intervalo para os tratamentos IMI10 e IMI10+F. ** indica maior atividade comportamental geral. ++ indica menor atividade comportamental geral (ANOVA seguida do teste de Duncan, p<0,05).

4.2 – Experimento 2: Efeito da administração do imi daclopride e do fungo


Para o teste preliminar ao experimento 2 os resultados mostraram que não

houve diferenças entre os 3 ninhos tanto para a auto-limpeza [F(2,47) = 0,15; p>0,05]

quanto para a locomoção [F(2,47) = 0,10; p>0,05]. Da mesma forma não houve diferenças

no experimento 2 entre os 3 ninhos para a auto-limpeza [F(2,143) = 0,33; p>0,05], para a

locomoção [F(2,143) = 2,74; p>0,05], para a limpeza coletiva [F(2,143) = 1,06; p>0,05], para

a antenação [F(2,143) = 0,70; p>0,05] e para os comportamentos agonísticos [F(2,143) =

0,20; p>0,5] (ANOVA de um fator).

AU

TO

-LIM

PE

ZA

(s)

0

20

40

60

80


LOC

OM

OÇ

ÃO

(cm

)

0

200

400

600

800

CONTROLEFUNGOIMI 10IMI 10+ F


*

+

A B

***

+

++

29

Objetivando-se verificar se o uso de tinta para marcar as formigas produziu

alterações comportamentais, comparou-se formigas marcadas (tratamento veículo-

marcado e tratamento fungo-marcado) com formigas não marcadas provenientes do

experimento 1 (tratamentos veículo e fungo). Os resultados (ANOVA de um fator)

mostraram que houve diferenças entre os tratamentos para a auto-limpeza [F(3,92) =

54,97; p<0,01] e para a locomoção [F(3,92) = 12,68; p<0,01]. Os tratamentos fungo e

fungo-tinta não diferiram entre si quanto à auto-limpeza e locomoção (p>0,05), porém

apresentaram maior tempo de auto-limpeza e menor atividade locomotora quando

comparados aos tratamentos veículo e veículo-tinta (p<0,05), sendo estes dois últimos

tratamentos também iguais entre si para a auto-limpeza e para a locomoção (p>0,05)

(dados não mostrados).

Por este experimento apresentar três tratamentos veículos (tratamentos

10NT+1NT, 10NT+1Veic-F e 10Veic-IMI+1Veic-F), realizou-se uma análise estatística

(ANOVA de um fator) entre esses tratamentos para se verificar se existiam diferenças

entre eles. Os resultados mostram que não houve diferenças entre os tratamentos

quanto à auto-limpeza [F(2,69)= 1,65; p>0,05], à locomoção [F(2,69)= 0,19; p>0,05], à

limpeza coletiva [F(2,69)= 0,10; p>0,05], à antenação [F(2,69)= 0,12; p>0,05] e aos

comportamentos agonísticos [F(2,69)= 0,08; p>0,05]. Esse resultado permitiu a junção

desses tratamentos para formar o que foi chamado de tratamento CONTROLE (n=72).

Da mesma forma, devido a existência nesse experimento de dois tratamentos

formados por 10 formigas veículos mais uma formiga que recebeu fungo (10NT+1F e

10Veic-IMI+1F), realizou-se uma análise estatística (ANOVA de um fator) entre esses

tratamentos para se verificar se existiam diferenças entre eles. Os resultados

mostraram que não houve diferenças entre esses tratamentos quanto à auto-limpeza

[F(1,46)= 0,01; p>0,05], à locomoção [F(1,46)= 2,42; p>0,05], à limpeza coletiva [F(1,46)=

0,31; p>0,05], à antenação [F(1,46)= 0,04; p>0,05] e aos comportamentos agonísticos

[F(1,46)= 0,08; p>0,05]. Esse resultado permitiu a junção desses dois tratamentos em um

só para formar o que foi chamado de S/IMI (n=48), conseqüentemente o grupo 10IMI+F

passou a ser chamado de C/IMI (n=24).

30

Portanto, para análise e apresentação dos resultados, utilizou-se os seguintes

tratamentos experimentais: CONTROLE (n de formigas marcadas=72), S/IMI (n de

formigas marcadas=48) e C/IMI (n de formigas marcadas=24). Além disso, nesse

experimento utilizou-se o imidaclopride na concentração de 10 ng/inseto, pois essa

concentração produziu efeitos opostos aos produzidos pelo fungo na locomoção

(aumento da atividade locomotora) e na auto-limpeza (diminuição do tempo de auto-

limpeza).

A quantificação dos comportamentos de auto-limpeza (média do tempo em

segundos) e locomoção (número de cruzamentos) exibidos pelas formigas marcadas

que foram colocadas na presença de outras formigas não marcadas são mostrados na

Figura 5. Para a auto-limpeza (Fig. 5A), os resultados mostraram que houve interação

intervalo x tratamento [F(2,141)= 18,24; p<0,01], houve efeito do fator tratamento [F(2,141)=

40,74; p<0,01] e do fator intervalo [F(1,141)= 48,17; p<0,01]. Na análise da interação

intervalo X tratamento, os resultados mostraram que no primeiro intervalo, as formigas

marcadas do tratamento S/IMI apresentaram maior tempo de auto-limpeza que as

formigas marcadas dos outros tratamentos (p<0,05). As formigas marcadas do grupo

CONTROLE apresentaram o menor tempo de auto-limpeza (p<0,05). No segundo

intervalo, as formigas marcadas do tratamento C/IMI apresentaram tempo de auto-

limpeza maior que todas as formigas marcadas dos outros tratamentos (p<0,05) e as

formigas marcadas do tratamento 10-CONT+1CONT apresentaram tempo de auto-

limpeza menor que todas as formigas marcadas dos tratamentos S/IMI e C/IMI

(p<0,05). Entretanto, ao se analisar o comportamento de auto-limpeza utilizando-se o

tempo total de teste (Fig. 5A1) verificou-se que as formigas marcadas dos tratamentos

S/IMI e C/IMI apresentaram tempo de auto-limpeza menor que as formigas marcadas

do tratamento CONTROLE (p<0,05). Os resultados mostraram também que para todas

as formigas marcadas de todos os tratamentos houve diminuição da auto-limpeza no

decorrer da sessão experimental (p<0,05; teste-t para amostras dependentes).

31

Para a locomoção (Fig. 5B), os resultados mostraram que houve efeito do fator

tratamento [F(2,141)= 26,45; p<0,01] e do fator intervalo [F(1,141)= 52,11; p<0,01], porém

não houve interação intervalo x tratamento [F(2,141)= 0,05; p>0,05]. O teste de

comparações múltiplas de Duncan mostrou que as formigas marcadas dos tratamentos

S/IMI e C/IMI apresentaram nível de locomoção similar, porém esse nível de atividade

locomotora foi menor do que o apresentado pelas formigas marcadas do tratamento

CONTROLE (p<0,05). A locomoção no primeiro intervalo foi maior que no segundo

intervalo para todos os tratamentos (p<0,05).

Figura 5: Quantificação dos comportamentos de auto-limpeza (A) e de locomoção (B) observadas em tratamento (média e erro padrão da média). * indica atividade comportamental maior que todos os tratamentos dentro do mesmo intervalo. + indica atividade comportamental menor que todos os tratamentos dentro do mesmo intervalo. ** indica atividade comportamental maior no tempo total. ++ indica atividade comportamental menor no tempo total (ANOVA seguida do Teste de Duncan, p<0,05).

A quantificação do comportamento de limpeza coletiva (tempo em segundos) que

as formigas marcadas receberam das formigas companheiras não marcadas são

apresentados na Figura 6. Os resultados mostraram que houve interação intervalo x

tratamento [F(2,141)= 17,81; p<0,01], houve efeito do fator tratamento [F(2,141)= 20,83;

p<0,01] e do fator intervalo [F(1,141)= 15,91; p<0,01]. Na análise da interação intervalo X


AU

TO

-LIM

PE

ZA

(s)

0

20

40

60

80

1 2

LOC

OM

OÇ

ÃO

(cr

uzam

ento

)

0

20

40

60

80

100

CONTROLES/IMIC/IMI


1 2

*

*

++++

A B

0

20

40

60

80

**

A1

32

tratamento, os resultados mostraram que as formigas marcadas dos tratamentos

CONTROLE e C/IMI receberam menor tempo de limpeza coletiva que as formigas

marcadas do tratamento S/IMI em ambos os intervalos (p<0,05). Os resultados também

mostraram que houve uma redução no tempo de limpeza coletiva do primeiro para o

segundo intervalo para todos os tratamentos (p<0,05).

Figura 6: Quantificação do comportamento de limpeza coletiva em formigas acompanhadas (média e erro padrão da média). + indica que os tratamentos CONTROLE e C/IMI apresentaram o menor tempo de limpeza coletiva (nos dois intervalos) quando comparados ao tratamento S/IMI (ANOVA seguida do Teste de Duncan, p<0,05).


LIM

PE

ZA

CO

LET

IVA

(s)

0

5

10

15

CONTROLES/IMIC/IMI

1 2

++

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

33

A quantificação do comportamento de antenação recebido pela formiga marcada

quando colocada na presença de formigas não marcadas são apresentados na Figura

7. Os resultados mostraram que houve interação intervalo x tratamento [F(2,141)= 4,95;

p<0,01], houve efeito do fator tratamento [F(2,141)= 22,68; p<0,01] e do fator intervalo

[F(1,141)= 98,59; p<0,01]. Na análise da interação intervalo X tratamento, os resultados

mostraram que as formigas marcadas dos tratamentos CONTROLE e C/IMI receberam

tempo de antenação menor que as formigas marcadas do tratamento S/IMI (p<0,05) em

ambos os intervalos. Os resultados também mostraram que o tempo de antenação no

primeiro intervalo foi maior que no segundo intervalo para todos os tratamentos

(p<0,05).

Figura 7: Quantificação do comportamento de antenação em formigas acompanhadas (média e erro padrão da média). + indica que os tratamentos CONTROLE e C/IMI apresentaram tempo de antenação menor que o tratamento S/IMI em ambos os intervalos (ANOVA seguida do Teste de Duncan, p<0,05).


AN

TE

NA

ÇÃ

O (

s)

0

5

10

15

20

25

30

35CONTROLES/IMIC/IMI

1 2

+

+

34

A quantificação dos comportamentos agonísticos realizados pelas formigas com

ou sem inseticida na presença de uma formiga (a formiga marcada dos grupos S/IMI e

C/IMI) que teve contato com o fungo são mostrados na Figura 8. Os resultados

mostraram que houve interação intervalo x tratamento [F(2,141)= 41,79; p<0,01], houve

efeito do fator tratamento [F(2,141)= 34,31; p<0,01] e do fator intervalo [F(1,141)= 198,69;

p<0,01]. Na análise da interação intervalo X tratamento, os resultados mostraram que

no primeiro intervalo, as formigas não marcadas pertencentes ao tratamento C/IMI, as

quais tiveram contato com IMI 10 ng/inseto, emitiram um número maior de

comportamentos agonísticos direcionados à formiga com fungo (marcada) (p<0,05). Por

outro lado, as formigas não marcadas pertencentes ao tratamento S/IMI, as quais

receberam veículo, emitiram um número menor de comportamentos agonísticos

direcionados às formigas marcadas, as quais foram administradas com a solução do

fungo (p<0,05).

No segundo intervalo, as formigas não marcadas pertencentes ao tratamento

S/IMI exibiram um número menor de comportamentos agonísticos direcionados às

formigas marcadas, as quais foram administradas com a solução do fungo, do que as

outras formigas não marcadas pertencentes aos outros tratamentos experimentais

(p<0,05). Não houve diferenças na emissão de comportamentos agonísticos entre as

formigas não marcadas pertencentes ao tratamento CONTROLE e ao tratamento C/IMI

(p<0,05). Os resultados também mostraram que as formigas não marcadas emitiram

um maior número de comportamentos agonísticos no primeiro que no segundo intervalo

para todos os tratamentos (p<0,05).

35

Figura 8: Quantificação dos comportamentos agonísticos em formigas observadas em tratamento (média e erro padrão da média). * indica maior emissão de comportamentos agonísticos que todos os tratamentos dentro do mesmo intervalo. + indica menor emissão de comportamentos agonísticos que todos os tratamentos dentro do mesmo intervalo (ANOVA seguida do Teste de Duncan, p<0,05).

4.3 – Comparação dos comportamentos de auto-limpeza e locomoção entre

formigas submetidas ao fungo e observadas individua lmente e observadas em

grupo

Esta análise teve por objetivo comparar a emissão do comportamento de auto-

limpeza e de locomoção entre formigas marcadas e observadas individualmente e

formigas marcadas e observadas em grupo.

Inicialmente, avaliou-se a existência de diferenças entre as formigas

provenientes dos três ninhos utilizados no experimento com relação aos

comportamentos de locomoção e auto-limpeza. Os resultados mostraram que não

houve diferença entre os 3 ninhos tanto para a auto-limpeza [F(2,167) = 0,02; p>0,5]

quanto para a locomoção [F(2,167) = 0,95; p>0,5].


CO

MP

OR

TA

ME

NT

OS

AG

ON

ÍST

ICO

S

0

2

4

6

8

10CONTROLES/IMIC/IMI

1 2

*

++

*

36

Devido a existência de dois tratamentos controles (10NT+1NT e 10NT+1Veic-F),

realizou-se uma análise estatística para se verificar se existiam diferenças entre esses

dois tratamentos. Os resultados mostraram que não houve diferença quanto à auto-

limpeza [F(1,46)= 2,47; p>0,05] e à locomoção [F(1,46)= 0,01; p>0,05]. Portanto, esse

resultado permitiu a junção desses dois tratamentos em um, formando o CONTROLE (n

de formigas marcadas=72).

A Figura 9 apresenta os comportamentos de auto-limpeza e locomoção das

formigas marcadas e observadas individualmente (tratamentos controle-individual e

fungo-individual) com auto-limpeza e locomoção das formigas marcadas e observadas

em tratamento (tratamentos controle-agrupado e fungo-agrupado). Para a auto-limpeza

(Fig. 9A), os resultados mostraram que houve interação intervalo x tratamento [F(3,116)=

12,65; p<0,01], houve efeito do fator tratamento [F(3,116)= 62,68; p<0,01] e do fator

intervalo [F(1,166)= 68,41; p<0,01]. Na análise da interação intervalo X tratamento, os

resultados mostraram que no primeiro intervalo as formigas que foram submetidas ao

contato com o fungo B. bassiana apresentaram maior tempo de auto-limpeza do que as

formigas controles. Sendo que as formigas individualizadas foram as que exibiram

maior tempo com este comportamento (p<0,05). No segundo intervalo, os resultados

mostraram que o tratamento fungo-individual continuou a apresentar tempo de auto-

limpeza maior que todos os outros tratamentos (p<0,05) e o tratamento fungo-agrupado

apresentou tempo de auto-limpeza maior que o tratamento controle-agrupado (p<0,05).

Os resultados também mostraram que o tempo de emissão de auto-limpeza foi maior

no primeiro do que no segundo intervalo para todos os tratamentos (p<0,05).

Para a locomoção (Fig. 9B), os resultados mostraram houve interação intervalo x

tratamento [F(3,116)= 49,51; p<0,01], houve efeito do fator tratamento [F(3,116)= 164,29;

p<0,01] e do fator intervalo [F(1,166)= 54,01; p<0,01]. Na análise da interação intervalo X

tratamento, os resultados mostraram que nos dois intervalos, o tratamento veículo-tinta

apresentou locomoção maior que todos os tratamentos (p<0,05). O tratamento controle-

individual apresentou locomoção maior que os tratamentos fungo-individual, controle-

agrupado e fungo-agrupado (p<0,05). O tratamento fungo-agrupado apresentou

locomoção menor que todos os tratamentos (p<0,05). Os resultados também

mostraram que a atividade locomotora foi maior no primeiro intervalo do que no

37

segundo para os tratamentos controle-agrupado e fungo-agrupado e a atividade

locomotora foi menor no primeiro intervalo do que no segundo para os tratamentos

controle-individual e fungo- individual (p<0,05).

Figura 9: Comparação dos comportamentos de auto-limpeza (A) e de locomoção (B) entre formigas observadas isoladamente e observadas em tratamento (média e erro padrão da média). ** indica maior atividade comportamental, comparada a todos os tratamentos dentro do mesmo intervalo. * indica maior atividade comportamental comparada aos tratamentos controle-agrupado e fungo-agrupado dentro do mesmo intervalo. + indica menor atividade comportamental que todos os tratamentos dentro do mesmo intervalo (ANOVA de um fator seguida do Teste de Duncan, p<0,05).

AU

TO

-LIM

PE

ZA

(s)

0

20

40

60

80

LOC

OM

OÇ

ÃO

(cr

uzam

ento

)

0

20

40

60

80

100

Controle-agrupadoFungo-agrupadoControle-individualFungo-individual


1 2


1 2

+

**

+

A B

**

*

*

+

**

**

+

38

V – DISCUSSÃO

O uso de fungos entomopatogênicos para o controle de uma gama de pragas se

mostra promissor (Charnely, 1997). Atualmente, não há relatos de uso de fungos em

programas de controle de formigas cortadeiras e atualmente a única forma de controle

em larga escala está baseada no uso de inseticidas químicos. Formigas cortadeiras são

capazes de reconhecer inimigos naturais como patógenos, que prejudicariam a saúde

da colônia. Na presença de patógenos elas ativam suas defesas comportamentais e

fisiológicas. O comportamento de limpeza (auto-limpeza e limpeza coletiva) remove

conídios de fungos entomopatogênicos e fungos parasitas (Escovopsis e Trichoderma),

reduzindo, portanto a possibilidade de infecções das próprias formigas e do jardim. Os

conídios ficam retidos na câmara infrabucal e, subsequentemente, são regurgitados e

depositados na lixeira da colônia. É interessante notar que as companheiras da colônia

mostram nível aumentado de agressividade contra formigas contaminadas (Hart e

Ratnieks, 2001). Igualmente, tem sido mostrado aumento de limpeza coletiva em

abelhas contaminadas com extrato bacteriano (Richard et al., 2008). De qualquer

forma, a defesa da colônia é de suma importância e o entendimento da mesma seria

necessário no planejamento de novas estratégias de controle microbiano, sendo

necessário “quebrar” a seqüência de eventos normais para que aconteça uma epizootia

na colônia.

39



locomoção de A. s. subterraneus

O presente estudo quantificou os efeitos do IMI, da suspensão conidial do fungo

e da associação entre o IMI e o fungo sobre os comportamentos de locomoção e auto-

limpeza de formigas observadas individualmente, a fim de se verificar os efeitos da

associação IMI + fungo nas formigas cortadeiras com a finalidade de desenvolver novas

estratégias de controle desta praga.

O experimento com a curva dose-resposta de IMI nas concentrações de 10, 20 e

40 ng/inseto mostrou que somente a concentração de 10 ng/inseto de IMI causou

alterações significativas nos comportamentos de locomoção e auto-limpeza, produzindo

aumento da locomoção e diminuição da auto-limpeza. Esses resultados estão de

acordo com relatos da literatura que mostram que a utilização de agonistas colinérgicos,

como o IMI, produz aumento da atividade locomotora. Por exemplo, Buhl et al. (2008)

verificaram que o agonista colinérgico carbacol (5 mmol.l–1) produziu aumento da

atividade locomotora, mensurada por meio do teste do “fictive flight” em gafanhotos.

Resultados semelhantes foram observados por Michelsen e Braun (1987) que relataram

que a administração unilateral de acetilcolina (40 nL, 10(-2) M) micro-injetada nas

proximidades do lóbulo alfa (50-100 micrometros) do corpo em forma de cogumelo

(“mushroom body”) produziu aumento do comportamento rotatório ipsilateral de abelhas

(índice de atividade locomotora). Entretanto, outros apresentam resultados

contraditórios quanto ao papel de agonistas colinérgicos, especificamente do IMI, na

locomoção. Por exemplo, Lambin et al. (2001) utilizando várias doses de IMI

administrado topicamente, observaram que concentrações elevadas (5; 10 e 20

ng/inseto) prejudicaram a atividade locomotora de abelhas, enquanto concentrações

baixas (1,25 e 2,5 ng/inseto) produziram aumento da atividade locomotora. Em contra

partida, Kunkel et al. (2001) mostraram que a exposição de besouros carabídeos ao IMI

por via tópica ou na dieta produziu uma incidência elevada de efeitos neurotóxicos

incluindo paralisia, prejuízo na locomoção e auto-limpeza excessiva.

40

Talvez, esses resultados contraditórios de aumento (Lambin et al., 2001) e de

diminuição (Kunkel et al., 2001) da locomoção utilizando IMI possam ser

neuroquimicamente justificados. Pois, ao contrário de alguns outros transmissores,

como, por exemplo, a octopamina e a tiramina, que exercem um papel bem

estabelecido no controle motor de insetos (Saraswati et al., 2004; Fox et al., 2006;

Fussnecker et al., 2006), é notório que a acetilcolina apresenta efeitos diferentes

dependendo da preparação que está sendo utilizada (Fok e Stein, 2002).

No experimento da curva dose-resposta de IMI, os resultados também

mostraram que o IMI 10 ng/inseto diminuiu o tempo de auto-limpeza. Esse resultado foi

oposto ao resultado obtido com a locomoção, entretanto resultados semelhantes foram

obtidos por Fussnecker et al. (2006), que verificaram que injeções de octopamina

(neurotransmissor do sistema nervoso de insetos) em Apis mellifera produziram

redução da auto-limpeza e aumento no andar. Em vertebrados é sabido que sistemas

de diferentes transmissores atuam mediando diferentes comportamentos. Por exemplo,

a ativação dos receptores dopaminérgicos D1 e D2 produz aumento da atividade

locomotora (Missale et al., 1998). Já a ativação dos receptores dopaminérgicos D1 ou a

ativação dos receptores serotoninérgicos 5-HT2c produzem um aumento do

comportamento de auto-limpeza (Page e Terry, 1997; Graf, 2006). Talvez seja possível

que o controle neuroquímico da locomoção e da auto-limpeza em insetos também siga

um padrão semelhante ao estabelecido em vertebrados. Além disso, ocorre entre o

comportamento locomotor e o comportamento de auto-limpeza o que se denomina de

competição comportamental (Bloise et al., 2007). Em termos anatômicos, as formigas

utilizam as pernas tanto para executarem a auto-limpeza quanto para executarem a

locomoção (Hölldobler e Wilson, 1990). Este fato, somado às observações em

laboratório (dados não mostrados) permitem afirmar que as formigas não podem

desempenhar locomoção e auto-limpeza concomitantemente. Portanto, fatores

fisiológicos e/ou anatômicos contribuem para que tais comportamentos sejam

quantitativamente inversos, ou seja, enquanto o índice de atividade locomotora é alto, o

tempo de auto-limpeza é baixo.

Quanto aos efeitos comportamentais produzidos pelo fungo entomopatogênico

Beauveria bassiana CG24, verificou-se que a formulação com o fungo produziu um

41

padrão comportamental diferente do que foi produzido pelo imidaclopride 10 ng/inseto:

aumento no tempo de auto-limpeza e diminuição da locomoção. A auto-limpeza é um

comportamento que ocorre naturalmente nas espécies de insetos terrestres, sendo um

comportamento importante para a manutenção da superfície do tegumento livre de

parasitas (Sachs 1988; Spruijt et al., 1992). Além disso, relatos na literatura mostram

que insetos apresentam uma reação de auto-limpeza intensa quando entram em

contato com fungos entomopatogênicos. Por exemplo, Hughes et al. (2002) citaram que

a auto-limpeza é um dos comportamentos utilizados para reduzir o número de esporos

sobre a cutícula de formigas. Jaccoud et al. (1999) observaram aumento imediato do

comportamento de limpeza após a adição de esporos do fungo Metarhizium em mini-

formigueiros. Santos et al. (2007) observaram que o IMI aumentou o poder de

infectividade do fungo B. bassiana. Segundo estes autores esse resultado poderia ter

ocorrido devido a capacidade do IMI em minimizar o comportamento de limpeza que é

normalmente produzido pelo fungo.

Os experimentos de Diehl-Fleig (1995) indicaram que o comportamento de auto-

limpeza também é exibido por formigas Acromyrmex contra fungos não

entomopatogênicos (Trichoderma viride e Penicillium sp), mostrando que formigas

reconhecem o fungo independente da sua patogenicidade. Por outro lado, apesar do

reconhecimento geral sobre a importância do comportamento de auto-limpeza como um

mecanismo eficiente na retirada de patógenos, Yanagawa et al. (2008) constataram que

a limpeza individual (auto-limpeza) de cupins era um comportamento ineficiente na

retirada de conídios, já que as pernas não são capazes de tirar os conídios do tórax.

Entretanto, esses mesmos autores afirmam que a limpeza coletiva é um

comportamento bastante eficaz na retirada de conídios do tórax dos cupins.

Quanto ao comportamento locomotor, os resultados mostraram que a

administração do fungo diminuiu a atividade locomotora das formigas. É sabido que de

uma cultura de fungo podem ser extraídas toxinas, como por exemplo, as beauvericinas

(Fukuda et al., 2004a). Talvez, toxinas da suspensão conidial utilizadas no presente

trabalho poderiam ser responsáveis pela diminuição da atividade locomotora das

formigas. Nesse sentido, Kucera e Samsináková (1968) verificaram que as toxinas

(eniatinas) presentes no substrato e nos esporos em fase de germinação produziram

42

paralisia nos insetos expostos ao fungo (larvas de Galleria mellonella). Ademais,

Charnley (1984) observou que sintomas comportamentais como paralisia geral ou

parcial e lentidão em insetos (Manduca sexta) são consistentes com a ação de toxinas

neuromusculares. É importante ressaltar que no presente trabalho a suspensão conidial

foi preparada a partir do substrato do fungo, onde podem ser encontradas toxinas

(Logrieco et al., 1998; Nilanonta et al., 2002; Fukuda et al., 2004a; Fukuda et al.,

2004b), as quais possivelmente foram absorvidas pelos insetos e produziram seus

efeitos comportamentais.

Quanto à associação entre o IMI e a suspensão conidial do fungo Beauveria

bassiana, os resultados mostraram que o IMI (10 ng/inseto) foi capaz de bloquear os

comportamentos (aumento da auto-limpeza e diminuição da locomoção) produzidos

pelo fungo. O bloqueio da exacerbação da auto-limpeza está de acordo com Boucias et

al. (1996) que mostraram que o imidaclopride reduziu o comportamento de auto-limpeza

em cupins infectados com o fungo Beauveria bassiana. Esse efeito pôde ser inferido

pelo aumento do número de conídios aderidos ao tegumento dos insetos (Boucias et

al., 1996). Santos et al. (2007) verificaram que a porcentagem de mortalidade das

formigas tratadas com IMI 10 ppm (concentração mais baixa) + fungo (B. bassiana

CG24) foi 20% maior do que aquelas tratadas somente com o fungo.

Quanto à locomoção, os resultados mostraram que o IMI (10 ng/inseto) bloqueou

a hipocinesia produzida pelo fungo. Isso permite sugerir que o IMI, na concentração de

10 ng/inseto, antagonizou a capacidade do fungo em produzir hipocinesia.

A comparação entre os tratamentos IMI 10 ng/inseto, IMI 10 ng/inseto + fungo,

fungo e controle, mostrou que a associação entre o IMI 10 ng/inseto e o fungo diminuiu

o comportamento de auto-limpeza e colocou a atividade locomotora nos mesmos níveis

que a locomoção apresentada pelo tratamento controle, ou seja, níveis basais. Esses

resultados mostram que o IMI 10 ng/inseto em associação com o fungo diminuiu o

tempo de auto-limpeza sem prejudicar a atividade locomotora, indicando que a

diminuição da auto-limpeza não foi devido a um problema motor, em comparação com a

associação entre o IMI 40 ng/inseto e o fungo, no qual houve diminuição do

comportamento de auto-limpeza juntamente com a diminuição da atividade locomotora.

Esses resultados estão de acordo com os resultados apresentados por Quintela e

43

McCoy (1998), que demonstraram que o IMI inibiu a limpeza em Diaprepes abbreviatus,

resultando no aumento da infecção fúngica. Quintela e McCoy (1997) verificaram que

os fungos B. bassiana ou M. anisopliae combinados com doses sub-letais de IMI

aumentaram de uma forma sinérgica a mortalidade em Diaprepes abbreviatus. Além

disso, Purwar e Sachan (2006) mostraram que a combinação de imidaclopride com B.

bassiana ou M. anisopliae aumentou a virulência destes patógenos. Os resultados

deste trabalho revelaram que é possível supor que essa concentração de imidaclopride

é capaz de inibir os comportamentos de defesa contra patógenos das formigas.

5.2 – Experimento 2: Efeitos da administração do im idaclopride e do fungo


Modificando o desenho do primeiro experimento onde formigas foram

observadas isoladamente, no segundo experimento, formigas foram observadas em

situação de grupo. O experimento 2 objetivou verificar como as formigas tratadas com o

IMI reagiam contra as formigas infectadas com o fungo, ou seja, se o IMI foi capaz de

alterar as interações sociais induzidas pelo contato com formigas infectadas com o

fungo.

Inicialmente, os resultados da locomoção mostraram que as formigas tratadas

com fungo e que interagiram com formigas do tratamento controle (tratamento S/IMI) ou

que interagiram com formigas tratadas com IMI (tratamento C/IMI) apresentaram uma

diminuição da locomoção (número de cruzamentos) quando comparadas às formigas

controles (tratamento 10CONT+1CON). Esses resultados estão de acordo com os

resultados do experimento 1, onde foi visto que a administração de fungo diminuiu a

locomoção. Entretanto, ao se comparar a atividade locomotora das formigas que

receberam fungo e foram observadas em grupo com a atividade locomotora das

formigas que receberam fungo, mas foram observadas individualmente (Fig. 9B),

verificou-se que as formigas em grupo apresentaram menor locomoção que às

observadas individualmente. Além disso, as formigas observadas em grupo

apresentaram um padrão de locomoção diferente das formigas observadas

44

individualmente, isto é, enquanto houve uma diminuição da atividade locomotora ao

longo da sessão experimental para as formigas observadas em grupo, houve um

aumento da locomoção ao longo do tempo para as formigas observadas

individualmente. É importante ressaltar que a diminuição da atividade locomotora ao

longo do tempo foi observada tanto para as formigas que receberam fungo quanto para

as formigas controles, mostrando que além de ser um efeito do tratamento (fungo) foi

também um efeito da interação com outras formigas. Apontando para a mesma direção,

Aubert e Richard (2008) encontraram uma diminuição da locomoção de formigas

durante o encontro social quando comparada às formigas que foram observadas

isoladamente. Estes autores sugeriram que a hipocinesia ocorreu em conseqüência do

aumento da limpeza e de outras atividades sociais.

Os resultados também mostraram que as formigas tratadas com fungo e que

interagiram com formigas tratadas como controle (tratamento S/IMI) ou que interagiram

com formigas tratadas com IMI (tratamento C/IMI) apresentaram aumento da auto-

limpeza quando comparadas às formigas controles (tratamento 10CONT+1CON).

Esses resultados replicam os resultados obtidos no experimento 1 do presente trabalho

com formigas observadas individualmente e corroboram dados da literatura no que diz

respeito à reação de auto-limpeza dos insetos frente ao contato com fungos

entomopatogênicos (Jaccoud et al., 1999; Hughes et al., 2002; Santos et al., 2007).

Entretanto, ao se comparar o tempo de auto-limpeza das formigas testadas em grupo

com as formigas testadas individualmente (Fig. 9A), observou-se que o tempo de auto-

limpeza das formigas em grupo foi menor que das formigas testadas individualmente.

Conjuntamente, esses resultados permitem sugerir que a interação social pode

comprometer outros comportamentos, tais como auto-limpeza e locomoção (Aubert e

Richard, 2008).

Uma característica significativa no convívio social de insetos é a capacidade de

reconhecimento entre as companheiras de ninho, o que beneficia a integridade e a

preservação do ninho. Este reconhecimento depende freqüentemente do contato

antenal (antenação), ou seja, do olfato (Wilson, 1971. Hildebrand and Shepherd (1997)

verificaram que os odores em abelhas são detectados por receptores olfatórios

encontrados nas antenas. Os resultados do presente experimento mostraram que uma

45

formiga infectada com fungo estimulou o comportamento de antenação emitido pelas

formigas companheiras (S/IMI). Entretanto, o mesmo não aconteceu com as formigas

companheiras tratadas com IMI10 (C/IMI), as quais emitiram tempo de antenação igual

às formigas companheiras não tratadas (controles) que interagiram com outras formigas

controles (CONTROLE), mostrando que o IMI conduziu a antenação contra a formiga

infectada com fungo a níveis basais (Fig. 7). É sabido da existência de receptores

nicotínicos localizados no lóbulo antenal de abelhas (Bicker, 1999) e estes são

funcionais (Barbara et al., 2008). Além disso, trabalhos mostram que as vias olfatórias

são mediadas, em sua grande maioria, pelo sistema colinérgico (Homberg, 2002).

Assim, talvez, no presente trabalho, a atuação do IMI sobre o sistema colinérgico do

lóbulo antenal das formigas tenha comprometido o comportamento de antenação (o

olfato). Uma outra possibilidade seria a existência de competição comportamental já

que o IMI exacerbou a locomoção e os comportamentos agonísticos.

Outra interação social importante para os insetos é o que se denomina de

comportamentos agonísticos. A estimativa da ocorrência de comportamentos

agonísticos é um instrumento que tem sido usado para estabelecer a hierarquia de

dominância de uma colônia (Monnin e Peeters, 1999). No presente trabalho, os

resultados mostraram que as formigas companheiras e tratadas como controles (as 10

formigas do tratamento S/IMI) apresentaram uma emissão baixa de comportamentos

agonísticos contra às formigas infectadas com o fungo. É possível que esta baixa

emissão de comportamentos agonísticos seja um mecanismo de defesa, pois as

interações entre as companheiras de ninho poderiam aumentar a transmissão de

parasitas (Aubert e Richard, 2008). Entretanto, seria de se esperar um aumento na

emissão de comportamentos agonísticos em direção às formigas infectadas com o

fungo, pois foi observado por Richard et al. (2008) que abelhas tratadas com extrato de

toxina bacteriana (lipopolissacarídeo) estimularam mais interações agonísticas de suas

companheiras.

Por outro lado, os resultados do presente trabalho mostraram que as formigas

companheiras tratadas com IMI10 (C/IMI) apresentaram uma emissão elevada de

comportamentos agonísticos contra às formigas infectadas com o fungo. Esses

resultados corroboram os resultados apresentados por Kostowski (1968) que

46

demonstrou que a aplicação de agentes anticolinérgicos (como por exemplo a atropina

e a escopolamina) em formigas resultou numa diminuição dos comportamentos

agonísticos.

O contato de insetos sociais com outros companheiros infectados não resulta

apenas em comportamentos agonísticos e em contatos antenais. Drees et al. (1992)

observaram aumento da limpeza coletiva (“allogroming”) de formigas em resposta à

exposição a nematóides patogênicos. Os resultados do presente experimento

mostraram que as formigas companheiras não tratadas (as 10 formigas do tratamento

S/IMI) emitiram um tempo maior de limpeza coletiva em direção às formigas infectadas

com o fungo. Contrariamente, as formigas companheiras tratadas com IMI10 (as 10

formigas do tratamento C/IMI) emitiram um tempo menor de limpeza coletiva em

direção às formigas infectadas com o fungo, mostrando assim que o IMI10 (tratamento

C/IMI) prejudicou a limpeza coletiva ou produziu um comportamento de indiferença em

relação ao fungo já que os resultados do tratamento C/IMI não foram diferentes dos

resultados vistos para o tratamento controle (tratamento 10CON+1CON). Sabe-se que

o comportamento de defesa em insetos sociais desempenha um papel crucial na

resistência dos indivíduos contra patógenos (Richard et al., 2008). Shimizu e Yamaji

(2003) e Myles (2002) mostraram que cupins usam o comportamento de limpeza para

se protegerem contra a infecção de fungos entomopatogênicos. Segundo Hughes et al.

(2002) e Calleri et al. (2006), os parasitas quando penetram o ninho de formigas ou

cupins podem ser fisicamente removidos pela limpeza coletiva, a qual é um

comportamento que aumenta a taxa de sobrevivência dos insetos infectados e a

resistência contra patógenos.

Os comportamentos sociais, incluindo a limpeza coletiva, são de suma

importância para a adaptação dos insetos ao seu ambiente (Rosengaus et al., 1998). A

sociabilidade confere mecanismos comportamentais aos cupins de adaptação contra

patógenos comumente encontrados na comunidade microbiana do ninho. Segundo

Aubert e Richard (2008), os insetos sociais parecem ter desenvolvido várias adaptações

para evitar ou combater as infecções, resultando na anulação ou na eliminação dos

parasitas. Os mecanismos de defesa contra patógenos/doenças vêm sendo

desenvolvidos através de milhões de anos de evolução e são notavelmente bem

47

conservados ao longo das espécies, desde invertebrados até os vertebrados (Aubert,

2007; Borregard et al., 2000).

48

VI – CONCLUSÃO

• O fungo entomopatogênico Beauveria bassiana aumentou o comportamento de

auto-limpeza e diminuiu a locomoção de formigas testadas individualmente.

• O imidaclopride na concentração de 10 ng/inseto diminuiu o comportamento de

auto-limpeza e aumentou a locomoção de formigas testadas individualmente.

• O imidaclopride 10 ng/inseto reverteu o padrão locomotor e o padrão de auto-

limpeza produzidos pelo fungo de formigas testadas individualmente.

• As formigas companheiras tratadas com veículo (ou que não receberam

tratamento) limparam por mais tempo as formigas infectadas com o fungo do que

as companheiras tratadas com imidaclopride 10 ng/inseto.

• As formigas companheiras tratadas com veículo (ou que não receberam

tratamento) mantiveram contatos antenais por mais tempo com a formiga tratada

com fungo do que as companheiras tratadas com imidaclopride 10 ng/inseto.

Elas também exibiram menos comportamentos agonísticos direcionados às

formigas tratadas com fungo do que as formigas companheiras tratadas com

imidaclopride.

• O imidaclopride (10 ng/inseto) quando administrado nas formigas companheiras

de ninho foi capaz de alterar o padrão dos comportamentos agonísticos, de

limpeza coletiva e de antenação induzidos pelo fungo.

49

• O imidaclopride numa concentração baixa inibiu os comportamentos naturais

relacionados à defesa de formigas contra o fungo.

• O imidaclopride 10 ng/inseto merece maiores investigações sobre o seu

potencial no controle microbiológico de formigas cortadeiras.

50

VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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a interaÇÃo entre imidaclopride e beauveria bassiana … · meu avô wallace, motivos da minha...

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