a genômica funcional no Âmbito da produção animal

Revista Brasileira de Zootecnia 2007 Sociedade Brasileira de Zootecnia

ISSN impresso: 1516-3598ISSN on-line: 1806-9290www.sbz.org.br

R. Bras. Zootec., v.36, suplemento especial, p.331-341, 2007

A genmica funcional no mbito da produo animal:estado da arte e perspectivas

Luiz Roberto Furlan1, Andr Luiz Julien Ferraz2, Julio Csar Bortolossi2

1 - Departamento de Melhoramento e Nutrio Animal, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia/FMVZ, UNESP, Botucatu,Brasil. E-mail: [email protected] - Departamento de Tecnologia, Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias/FCAV, UNESP, Jaboticabal, Brasil.

RESUMO - Os ltimos vinte anos caracterizaram-se pela proliferao de tecnologias que tornarampossvel decifrar o genoma das espcies, localizar e identificar particularidades na sua seqncia, elucidar as suasfunes dentro dos sistemas biolgicos e, sobretudo, comear a entender os mecanismos que controlam as interaesentre os gentipos e os estmulos ambientais, que so responsveis pela diversidade fenotpica. Estes estudos sobreas bases moleculares da variabilidade fenotpica abriram uma nova abordagem cientfica, caracterizada pelamultiplicidade das questes envolvidas, que resultou no surgimento de novas reas de pesquisa, cujos conhecimentosesto sendo aplicados em diversos campos da biologia, inclusive na zootecnia. Tendo em vista o grande impactoque tais conhecimentos esto tendo sobre a compreenso dos fenmenos biolgicos, parece ser oportuno fazer umaavaliao das potencialidades de aplicao das abordagens de Genmica Funcional em pesquisas de nutrio ealimentao de ruminantes. Nesse contexto, este artigo est focado na descrio das principais ferramentasgenmicas disponveis e na discusso sobre a viabilidade de se utilizar as informaes por elas geradas em benefcioda produo animal.

Palavras-chave: bovinos, expresso gnica, genmica funcional, microarrays, nutrio, polimorfismo

Functional genomics in the field of animal science:state-of-the-art and perspectives

ABSTRACT - The last twenty years have been characterized by some remarkable technological advances inthe field of genomics which were essential to unveil the genome of varies species. Furthermore, these genomicadvances contributed to pinpoint particularities in genome sequences which might be associated with phenotypicvariations, therefore, it became possible to study functions associated with specific sequences in a more holisticcontext within biological systems. More importantly, the blossoming in genomics contributed to a betterunderstanding on the mechanisms that control the interactions between genotype and environmental factors whichare responsible for phenotypic variability. Genomic advances also promoted innovative and multi-dimensionalscientific perspectives in research fields of biology, such as in animal science. Having in mind the remarkableimpacts of genomics on the understanding of biological phenomena, it becomes clear that an assessment of thepotential applications of functional genomics in the field ruminant nutrition should be performed. For this reason,this paper reviews several important genomic tools, and discusses the feasibility of using these tools towards anenhancement of animal production.

Key Words: bovine, functional genomics, gene expression, microarrays, nutrition, polymorphism

Correspondncias devem ser enviadas para: [email protected]

Introduo

Os conhecimentos sobre a natureza e contedoda informao gentica, assim como as tecnologiasdisponveis para o seqenciamento de genomasem larga escala, evoluram de uma forma sem

precedentes nas duas ltimas dcadas, permitindoque os bancos de dados pblicos acumulassem umenorme volume de informaes acerca dasseqncias de nucleotdeos de diversos genomas,dentre os quais o dos bovinos e de outros animaisde interesse zootcnico.

2007 Sociedade Brasileira de Zootecnia

332 Furlan et al.

Contudo, os dados obtidos nos projetos deseqenciamento no tm contribudo da formaesperada para o melhor entendimento do papel queos genes e as protenas desempenham nofuncionamento dos organismos, uma vez que ogenoma um elemento virtualmente esttico, aopasso que seus produtos, representados pelosRNAs mensageiros (transcriptoma) e protenas(proteoma), possuem um carter dinmico,caracterizado por mudanas contnuas em resposta estmulos internos e externos (Greenbaum et al.,2001).

Assim sendo, ainda no auge da etapa de se-qenciamento de genomas, comearam a surgirnovas plataformas de pesquisa que possibilitamposicionar as funes individuais dos genes e seusprodutos (RNAs e protenas) dentro de umcontexto global, dando incio a um novo campode estudos, denominado Genmica Funcional,cujas tcnicas analticas permitem avaliar os pa-dres de expresso gnica e protica nas clulas etecidos, pr-requisito bsico para se entender comoestas macromolculas interagem de maneiradinmica para produzir organismos complexos,capazes de se adaptar s influncias do meioambiente e a situaes fisiolgico-metablicasespecficas.

Os avanos tericos e tecnolgicos em nano-biotecnologia, robtica, gentica, matemtica ebiologia computacional, entre outros, foram osfatores determinantes que permitiram e facilitaramos grandes avanos que ocorreram nessa rea.

Os resultados das pesquisas em GenmicaFuncional, notadamente daquelas que envolvemindivduos geneticamente diferentes ou subme-tidos a condies contrastantes, tm permitido umentendimento mais rpido e preciso das relaesgene-fentipo, bem como dissecar as interaesgentipo-ambientais que ocasionam mudanassignificativas no fentipo dos indivduos. Emdecorrncia dessa nova abordagem cientfica, naqual ambos, gentipo e fentipo, so tratadosdentro de uma dimenso holstica, surgem novasreas de estudo, dentre as quais a GenmicaNutricional.

Genmica

Genmica rea da cincia que se dedica aoseqenciamento dos nucleotdeos, mapeamento e

anlise de genomas, os quais so constitudos portodo o DNA existente nas clulas de um indivduo,inclusive os seus genes estruturais, seqnciasregulatrias e regies no codificantes.

A histria do seqenciamento teve incio em1977 quando Frederich Sanger e seus colabora-dores descreveram uma metodologia para sedeterminar a ordem seqencial dos nucleotdeosque compe a estrutura do DNA, baseada noprincpio da terminao controlada da replicaopor didesoxinucleotdeos (Sanger et al., 1977).

Porm, na sua verso original, este mtodo noera uma ferramenta adequada para o seqen-ciamento de genomas complexos, da ordem demilhares, milhes, ou mesmo bilhes de pares debases, como o caso de organismos complexos(mamferos, por exemplo). Tampouco haviadisponibilidade de programas computacionais paraanalisar as seqncias geradas e orden-lascorretamente (processo chamado montagem dogenoma), de forma a reconstituir a disposio exataque os genes e demais componentes do genomaocupam no cromossomo.

De maneira que a genmica teve seu inciosomente no final da dcada de 80, aps o mtodode Sanger ter sido modificado para permitir oseqenciamento de forma automatizada eintegrada a um sistema de leitura computadorizado(Venter et al., 2001), possibilitando que esteprocesso fosse realizado em plataforma de largaescala e alta performance.

Um dos fatores que mais contribuiu para orpido desenvolvimento da genmica foi, sem amenor sombra de dvida, o Projeto GenomaHumano. Considerado um dos projetos cientficosmais ousados da histria, comeou a ser elaboradoem 1984 e foi desenvolvido nos anos subseqentespor um consrcio de cientistas dos Estados Unidos,Reino Unido, Japo, Frana, Alemanha e China,com o apoio financeiro de seus respectivosgovernos (Lander et al., 2001).

Dada sua magnitude cientfica e porte econ-mico, o Projeto Genoma Humano foi o fator deter-minante para proliferao de um setor industrialvoltado criao e aperfeioamento de produtose equipamentos utilizados em pesquisas dessanatureza. As tecnologias desenvolvidas por essesetor foram fundamentais para o aumento daeficincia e reduo dos custos do processo deseqenciamento.


333A genmica funcional no mbito da produo animal: estado da arte e perspectivas

A entrada do Brasil na chamada era genmicase deu somente em 1997, quando a FAPESP, como intuito de gerar competncia cientfica nesta reaemergente, criou o Programa Genoma e tomou ainiciativa de organizar a Rede ONSA(Organization for Nucleotide Sequencing andAnalysis), um consrcio de laboratrios ligados adiferentes instituies de pesquisa do Estado deSo Paulo, estruturado para funcionar como uminstituto virtual.

Desde que foi institudo, o Programa Genoma- FAPESP tem destinado expressivo volume derecursos financeiros, no apenas para a realizaode diversos projetos de seqenciamento, mas tam-bm para a concesso de bolsas de estudo que via-bilizam o treinamento e aperfeioamento de estu-dantes, tcnicos e pesquisadores. Tais investi-mentos tm resultado na capacitao de um contin-gente considervel de pesquisadores na rea degenmica, cuja produo cientfica, de altssimaqualidade, tem dado grande visibilidade ao Brasil

no cenrio internacional.Seguindo o modelo bem-sucedido da FAPESP,

em dezembro de 2000 o Ministrio da Cincia eTecnologia, por intermdio do Conselho Nacionalde Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico(CNPq), lanou o Projeto Genoma Brasileiro ecriou a Rede Nacional de Seqenciamento,ampliando a expertise na rea de Genmica emnvel nacional.

Impulsionada pela reduo dos custos doseqenciamento e pela maior facilidade de acessoa essa tecnologia, a expanso da genmica emmeados de 2000 foi um fenmeno que ocorreu anvel mundial, resultando no crescimentosignificativo do nmero de espcies a terem seugenoma seqenciado.

Como pode ser observado na Tabela 1, existematualmente 1.470 projetos de seqenciamento degrande porte cadastrados no NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information), cada umdeles dedicado a uma espcie diferente.

Tabela 1 - Estatstica dos Projetos de Seqenciamento de Genomas.Organismo Estatus Total

Completo Montando Em andamentoProcariotos 487 335 387 1209

Arqueobactrias 38 6 27 71Bactrias 449 329 360 1138

Eucariotos 26 99 136 261Animais 4 42 53 99

Mamferos 2 16 14 32Aves 1 1 2Peixes 3 3 6Insetos 1 15 17 33Vermes achatados 1 3 4Vermes redondos 1 2 3 6Anfbios 1 1Rpteis 2 2Outros animais 5 12 17

Plantas 5 2 37 44Plantas superiores 2 2 27 31Algas verdes 3 9 12

Fungos 10 38 20 68Ascomicetos 8 32 14 54Basidiomicetos 1 4 5 10Outros fungos 1 2 1 4

Protistas 7 15 25 47Apicomplexos 1 7 7 15Kinetoplastideos 1 2 6 9Outros protistas 5 6 11 22

Total 513 434 523 1470Fonte: NCBI 27/04/2007 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/gpstat.html)


334 Furlan et al.

Os procariotos, organismos com genomas maissimples e de menor tamanho, constituem-se nogrupo que tem maior nmero de projetos deseqenciamento. J em relao aos eucariotos, amaioria dos projetos est focada nas espcies doreino animal, predominantemente naquelas quepertencem ao grupo dos mamferos e dos insetos,nos quais se encontram as espcies de interessezootcnico (Tabela 2).

Em virtude da dimenso internacional e dagrande abrangncia cientfica, o Projeto GenomaBovino aquele que tem tido mais destaque dentreos projetos conduzidos com animais domsticos.Orado em cinqenta e trs milhes de dlares, oprojeto de seqenciamento e anotao do genomabovino, coordenado pelo Baylor College ofMedicine (Texas, USA) e conta com a participaode diversas instituies internacionais, inclusivedo Brasil.

Os dados gerados no Projeto Genoma Bovinodevero ser utilizados tanto para propsitos daproduo animal, quanto para os da sade humana,haja vista que os cromossomos das duas espciesapresentam grande sintenia e que estes animais sousados como modelo de estudo para diversosaspectos da fisiologia e tambm de algumas daspatologias humanas (Hocquette et al., 2007).

A ltima verso da montagem do genomabovino (Btau 3.1) pode ser acessada livrementeno endereo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/cow/, no qual tambm so encontrados linkspara diversos bancos de dados pblicos quecontm informaes sobre o assunto.

Outra abordagem bastante utilizada em gen-mica, particularmente em estudos com eucariotos, o seqenciamento das Etiquetas de SeqnciasExpressas ou ESTs (do ingls Expressed SequenceTags), cujo objetivo caracterizar a expressotemporal e local dos genes estruturais mediante aidentificao de seus respectivos RNAsmensageiros.

Devido a grande instabilidade das molculasde RNA, a estratgia utilizada nessa modalidadede seqenciamento a utilizao do princpio datranscrio reversa para converter o RNA mensa-geiro em seu DNA complementar (cDNA), queposteriormente ter as extremidades seqen-ciadas. Essas pequenas seqncias so entoanalisadas por programas computacionais (ferra-mentas de bioinformtica) que tm a capacidadede identificar o gene que lhes deu origem.

As colees de ESTs so muito importantespara os estudos de genmica funcional e tm sidolargamente utilizadas para identificao de novosgenes, mapeamento e anotao de transcritos(Smith et al., 2001), assim como para a construode mapas comparativos, utilizando informaesgeradas em projetos conduzidos com outras esp-cies (Liu et al., 2004). Alm disso, as bibliotecasde cDNA produzidas nestes projetos fornecem osubstrato para a confeco das lminas demicroarrays utilizadas nos ensaios de expressognica (Suchyta et al., 2003).

At o momento (Maio de 2007), j foramdepositadas mais de 1.300.000 ESTs da espciebovina no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.

Tabela 2 - Projetos de seqenciamento de animais domsticos.Organismo Tamanho do

genoma (Mb) Estatus Cobertura Grupo responsvelApis mellifera 200 Montado 8X Baylor College of MedicineBombis mori 530 Montado 6X Southwest Agricutural University, ChinaBos Taurus 3000 Montado 6X Cattle Genome Sequencing International

ConsortiumCanis familiaris 2400 Montado 1,5X TIGRCanis familiaris 2400 Montado 7,6X Dog Genome Sequencing ConsortiumEquus caballus - Montado 6,8X Broad InstituteFelis catus 3000 Montado 2X The Genome Sequencing Platform,

The Genome Assembly TeamGallus gallus 1200 Montado 6,6X International Chichen Genome

ConsortiumOryctolagus cuniculus 3500 Em andamento NISC-NIH Intramural Sequencing CenterOvis aries - Em andamento International Sheep Genomics ConsortiumSus scrofa 2800 Em andamento Swine Genome Sequencing Projetc (SGSP)

Fonte: NCBI 27/04/2007 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/leuks.cgi)



gov/Genbank/), a maior parte das quais proce-dentes de projetos desenvolvidos nos EstadosUnidos. De maneira que os bovinos ocupam aquarta colocao entre os organismos que possuemmaior nmero de ESTs seqenciadas.

O Brasil tambm deu sua contribuio para aproduo dessas colees de ESTs. Financiadoconjuntamente pela FAPESP e Central Bela Vista(http://www.centralbelavista.com.br/), o ProjetoGenoma Bovino gerou um banco de dados quecontm mais de 60.000 seqncias expressasexclusivamente em animais da subespcie Bosindicus. Alm disso, durante seu desenvolvimentoforam produzidas 18 bibliotecas de cDNA,algumas das quais tecido-especfica, que seconstituem num importante recurso para aconfeco de lminas de microarrays para estudosde expresso gnica com zebunos.

Uma aplicao imediata dos resultados obtidosnestes projetos de seqenciamento tem sido aconstruo de mapas genticos saturados paraidentificao de marcadores para caractersticasquantitativas.

A grande quantidade de SNPs (singlenucleotide polymorphisms) identificada nosbancos de dados desses projetos est sendoutilizada para saturar os mapas de QTLs(quantitative trait loci) existentes, com o intuito

de identificar os genes responsveis pelasvariaes fenotpicas em bovinos (Sonstegard &Van Tassel, 2004). Esta estratgia tem gerado umgrande nmero de marcadores moleculares queesto sendo usados para rastrear os animaisportadores de alelos ou combinao de alelos queaumentam a produo.

Alguns marcadores, cujos testes empregamtecnologias mais simples, j esto sendo comer-cializados ao nvel de criador (Tabela 3). Contudo,os mtodos de genotipagem em larga escala, quefazem a anlise simultnea de milhares de SNPs,ainda esto restritos ao campo da pesquisa.

preciso salientar que a avaliao da eficciadesses marcadores no melhoramento gentico ain-da se encontra em fase preliminar e, portanto, deveser considerada com cautela. Uma fonte confivelde informaes sobre a validao de alguns testescomerciais pode ser encontrada na pgina web doNational Beef Cattle Evaluation Consortium(http://www.nbcec.org/nbcec/index. html).

Genmica funcional

Genmica funcional a vertente da genmicacujo foco est voltado para a elucidao das fun-es que cada gene exerce no organismo e, ao mesmotempo, como esses genes interagem entre si dentro

Tabela 3 - Testes comerciais para a genotipagem de marcadores moleculares em bovinos (modificado deHocquette et al., 2007).Gene Caractersticas Ano Procedncia ComercializadorTG Marmoreio 2000 CSIRO/MLA Genetic Solutions P/LCAST Maciez da carne 2002 CSIRO/MLA/

Beef CRC Genetic Solutions P/LCAPN1 Maciez da carne 2003 USDA/AgResearch NZDGAT1 Produo de gordura 2003 Univ. de Lieve/

no leite Tech Uni Muench MerialGH1 Marmoreio 2003 NIAS, Japo Prescribe Genomics

COLEP Marmoreio/Gordura 2003 Univ. de

Saskatchewan MerialMltiplos testes Maciez da carne 2003/04 Genetic Solutions P/LGHR Produo de leite 2004 Univ. de Lieve MerialSCD Relao de cidos graxos 2004 Univ. Kobe Prescribe Genomics

COMltiplos testes Marmoreio 2004 Genetic Solutions P/LMltiplos testes Vrias caractersticas

para gado de leite 2004/05 MerialCAPN3 Maciez da carne 2006 CSIRO/MLA/

Beef CRC Genetic Solutions P/LMltiplos testes Eficincia alimentar 2006 CSIRO/MLA/

Beef CRC Genetic Solutions P/L


336 Furlan et al.

das redes biolgicas que controlam as caractersticasfenotpicas (Mutch et al., 2005). As duasabordagens mais utilizadas nesse campo de estudotm sido a anlise do perfil global da expressognica (transcriptoma) e a anlise sistemtica dasprotenas (proteoma).

Dentre as metodologias utilizadas nos estudosdo transcriptoma, a mais difundida a anlise daexpresso gnica por microarrays, uma vez quepermite a avaliao simultnea da expresso demilhares de genes em diferentes tecidos, proveni-entes de indivduos que foram submetidos acondies contrastantes ou que se encontram emdiferentes estgios do desenvolvimento (Schenaet al., 1995).

Esta tcnica baseada no uso de um chip deDNA, que nada mais do que uma plataformaslida, cuja superfcie contm um grande nmerode genes distribudos de forma ordenada. Emboraexistam variaes, o tipo mais comum aquele emque a matriz slida uma lmina de vidro usada emmicroscopia (tambm chamada de slide), contendomilhares de spots (locais onde se encontram osgenes), nos quais est depositada uma quantidadeinfinitamente pequena de DNA (sonda). As fontesde DNA mais comumente utilizadas como sondasso os produtos de PCR amplificados de cDNAs ouoligonucleotideos sintetizados a partir deseqncias depositadas no GenBank.

O fundamento dessa tecnologia a utilizaode um slide no qual as sondas foram imobilizadasem quantidades e posies precisamente definidas,para se fazer a hibridizao com um pool de RNAsmensageiros extrados de amostras biolgicas,previamente marcados com fluorforos (marca-dores florescentes), tambm chamados de alvosou targets. Aps o processo de hibridizao o slide lavado para remoo do targets excedentes (queno se ligaram sonda) e, em seguida, exposto araios laser para excitar os fluorforos, fazendo comestes emitam luz (fluorescncia).

Em princpio, quanto maior a expresso de umdeterminado gene, maior ser a quantidade detargets marcados com o fluorforo e, consequen-temente, maior ser a intensidade da fluorescciado complexo target-sonda aps a hibridizao(Hiendleder et al., 2005).

Devido ao seu carter prospectivo, e pelafacilidade em identificar genes diferencialmenteexpressos, as anlises de microarrays tm sido

extensivamente utilizadas nas reas mdica efarmacolgica, visando identificao de conjun-tos de genes associados pr-disposio e aodesenvolvimento de doenas, elaborao desistemas de diagnstico, e na identificao deprodutos com potencial teraputico (drogas enovos alvos para medicamentos).

Tendo em vista a complexidade dos fatoresenvolvidos nas respostas aos estados patolgicose na determinao das caractersticas produtivasnos animais domsticos, a utilizao da tecnologiade microarrays tem despertado grande interessepor parte dos setores ligados produo animal,pois ela permite a caracterizao dos status sani-trio, fisiolgico e nutricional de acordo com araa, tipo gentico, manejo aplicado ou mesmo oambiente de criao desses animais.

De fato, a disponibilidade de chips de DNApara os estudos de expresso gnica em animaistem aumentado significativamente nos ltimosanos e, atualmente, existem chips especficos paradiversas espcies de interesse zootcnico, inclusi-ve a bovina (Tabela 4).

No mbito da nutrio, a anlise do transcrip-toma uma ferramenta extremamente til para seinvestigar quais e de que maneira os genes soafetados pelos nutrientes essenciais e noessenciais, evidenciar novos mecanismos de aoe novas funes para os nutrientes, investigarpossveis efeitos colaterais provocados porcomponentes da dieta, determinar como asvariaes (diferenas individuais, estgio docrescimento ou do desenvolvimento, efeitosambientais, etc...) alteram as necessidades ou asrespostas do organismo a um dado nutriente oudieta, investigar quais as conseqncias dosdesbalanos nutricionais provocados pelainadequao das dietas, sem contar outrasabordagens genticas e evolucionrias relativas nutrio (German & Young, 2004).

Embora o volume de publicaes sobre o assuntoainda no seja expressivo, a tecnologia demicroarrays j esta sendo utilizada nos estudos denutrio dos ruminantes, notadamente naquelesdelineados para avaliar os efeitos do nvel nutricionalda dieta (Lehnert et al., 2006 ; Loor et al., 2007).

Apesar da crescente popularidade na aplicaodesta tecnologia, necessrio ressaltar que aformao do RNA mensageiro apenas o primeiropasso de uma longa seqncia de eventos que



resultam na sntese das protenas funcionais, queso, em ltima instncia, as molculas respon-sveis pelo fentipo das clulas.

Logo aps a transcrio do DNA, o RNAresultante est sujeito a modificaes (processa-mento alternativo, edio do RNA mensageiro epoliadenilao) que podem resultar na formao dediferentes isoformas de protenas, geradas a partirde um nico gene (Newman, 1998). Alm disso, osmecanismos que regulam o processo de traduo, asmodificaes ps-traducionais e, principalmente,o processo de protelise celular, so fatores queafetam significativamente as quantidades e ascaractersticas estruturais e funcionais das protenas(Graves & Haystead, 2002). Neste sentido, diversostrabalhos tm demonstrado que o contedo deprotenas na clula no um reflexo direto daabundancia dos RNAs mensageiros especficos(Gygi et al., 1999, Chen et al., 2002).

Assim sendo, as tecnologias que permitem acaracterizao do perfil global das protenas

presentes numa clula, tecido, ou organismo, comoo so a eletroforese bi-dimensional e a espectro-metria de massa, tornam-se ferramentas poderosaspara comparar diferentes estados de um sistemabiolgico, como por exemplo, entre sistemasnormais e doentes, resistentes e susceptveis ouainda com caractersticas fenotpicas positivas enegativas.

Em virtude da complexidade das misturasproticas que so analisadas em estudos doproteoma, primeiramente necessrio separ-laspara, posteriormente, fazer a identificao de cadaprotena individualmente.

Uma das tecnologias mais utilizadas paraseparao de protenas em misturas complexas a eletroforese bi-dimensional em gis depoliacrilamida ou simplesmente 2D-PAGE (Wang& Hanash, 2005).

Seu princpio baseado na conduo daeletroforese em duas etapas, com critrios diferen-tes de separao. Na chamada primeira dimenso,

Tabela 4 - Alguns exemplos de arrays disponveis para estudos de expresso gnica em bovino(modificado de Hocquette et al., 2007).Array Tipo Procedncia DetalhesMEM array cDNA Frana(1) 1896 cDNAs oriundos de msculo,

glndula mamria e embrio

NBFGC Microarray cDNA Universidade Estadual > 18000 transcritos de bibliotecas dede Michigan(2) vrios tecidos (MARC 1-4)

Bovi Analyzer cDNA Universidade Estadual 10608 cDNAs de Bibliotecas MARCde Iowa(3)

Beef CRC muscle cDNA CSIRO e Beef CRC, > 9000 sondas oriundas de bibliotecas deand fat array Austrlia(4) cDNAs de msculo esqueltico tecido

adiposo

Bos taurus Oligos Operon 8329 longos oligos de transcritos (EST)(bovine) OpArray longos Biotechnologies(5) bovinos

Gene Chip Pequenos Oligos Affymetrix(6) 23000 sondas representando genes sintetizados in situ contidos no GenBank

Bovine whole Oligos Consrcio de > 2005 genes oriundos de um banco degenome long longos microarray bovino, dados de ESToligonucleotdeo USA(7)expression array

Bos taurus e Oligos 21475 sondas representando 19500 genesde Array distintos longos Agilent(8) bovinos(1) = Bernard et al. (2005); (2) Suchyura et al. (2003); (3) = www.ans.iastate.edu/report/air/2004pdf/AS1877,pdf; (4) = Lehert et al. (2004); (5) = www.operon.com; (6) = www.affymetrix.com; (7) = Elsiket al. (2006); (8) = earrat.chem.agilent.com/earray.


338 Furlan et al.

as protenas so separadas pelo ponto isoeltricoem gradiente de pH e, em seguida (segundadimenso), separadas de acordo com o peso mole-cular. Nos passos subseqentes o gel corado,para a visualizao do padro de migrao de cadaprotena (spot), sendo em seguida digitalizado paraque sua imagem possa ser analisada. De maneira queas diferenas quantitativas e qualitativas no perfil deprotenas da amostra se refletem em alteraesquantitativas e qualitativas no padro de migraona eletroforese, as quais podem ser detectadas naanlise das imagens (Hiendleder et al., 2005).

Para a identificao das protenas que seencontram diferencialmente representadas naamostra, basta remover seu spot do gel e analis-lo por espectrometria de massa ou fazer oseqenciamento da poro N-terminal pelo mtodode degradao de Edman.

As tcnicas para o estudo do proteoma aindano se popularizaram com a mesma magnitude queas tcnicas utilizadas no estudo do transcriptoma,tampouco suas metodologias esto devidamentepadronizadas para permitir a comparao entreresultados que foram obtidos em experimentosdiferentes, porm conduzidos de forma similar.Contudo, a tendncia de que haja um aumentogradativo na sua utilizao, inclusive na reazootcnica.

A aplicao conjunta das tecnologias empre-gadas em estudos de transcriptoma (microarrays)e proteoma (eletroforese bi-dimensional e espec-trometria de massa) em ensaios que envolvemindivduos geneticamente diferentes, ou subme-tidos a condies ambientais contrastantes, permiteum entendimento mais rpido e preciso dasrelaes gene-fentipo, e possibilita dissecar asinteraes gentipo-ambientais que ocasionammudanas significativas no fentipo destesindivduos. A utilizao de ferramentas debioinformtica adequadas para uma anliseintegrada dos dados do genoma, transcriptoma eproteoma um ponto crucial para a obteno deresultados confiveis (Bailey, 1999).

Genmica nutricional

Genmica nutricional o novo campo danutrio que emerge na era ps-genmica com oobjetivo de elucidar a complexa interao existenteentre a dieta e o genoma dos indivduos, mediante

utilizao de tecnologias desenvolvidas paraanlise do transcriptoma e do proteoma (Mutch etal., 2005).

Definida como a interface entre o ambientenutricional e os processos gentico-celulares, aGenmica Nutricional dedica-se ao estudo dasinteraes entre os componentes qumicos dasdietas (nutrientes) e o material gentico dos indiv-duos (gentipo), ou seja, dos mecanismosmoleculares envolvidos na interao nutrientes-gentipo e a maneira como estas afetam o fentipo(Kaput & Rodriguez, 2004).

Dentro de seu escopo existem duas vertentesdistintas: a Nutrigenmica, voltada para oentendimento dos efeitos dos nutrientes sobre osmecanismos envolvidos na expresso gnica e aNutrigentica, que estuda os efeitos das variaesnas seqncias do DNA (polimorfismos) sobre oaproveitamento dos nutrientes e/ou o desenvolvi-mento de doenas metablicas.

Os efeitos dos componentes qumicos da dietasobre a expresso gnica podem ser diretos ouindiretos, dependendo do papel que estes desempe-nham dentro das clulas. Neste sentido, os nutri-entes podem:

1) atuar como ligantes para receptores defatores de transcrio;

2) serem metabolizados por rotas metablicasprimrias ou secundrias, alterando dessemodo as concentraes de substratos ouintermedirios;

3) influir positiva ou negativamente nas vias desinalizao celular (Kaput & Rodriguez,2004).

Uma das classes de nutrientes que afetam aexpresso gnica a dos cidos graxos polinsa-turados de cadeia longa ou LC-PUFA. Vriosestudos de expresso gnica por microarrays tmevidenciado os efeitos destes compostos sobrediversos processos fisiolgicos, dentre os quais ocrescimento, desenvolvimento neurolgico, ganhode massa muscular ou de gordura, reproduo,sistema imune inato e adquirido, sem contar quetambm esto relacionados com praticamentetodas as doenas crnicas e degenerativas queacometem os seres humanos.

Seu efeito sobre a expresso gnica nestagrande amplitude de processos est relacionadocom o fato de eles atuarem como ligantes para um



nmero significativo de fatores de transcrio, queatuam em vrios tecidos do organismo. De maneiraque os LC-PUFA constituem-se numa classe denutrientes ideal para estudos de nutrigenmica(Mutch et al., 2005)

Alm disso, esses cidos graxos esto relacio-nados com a modulao da atividade de protenase participam ativamente do metabolismo doslipdeos, fatos que concorrem para explicar amultiplicidade de aes.

A influncia dos nutrientes sobre a estabilidadedo genoma outra questo importante que temsido abordada em nutrigenmica. O estatusnutricional durante a fase de desenvolvimento fetalpode alterar o estado epigentico do genoma,afetando os nveis da expresso gnica durantetoda a vida ps-natal (Stover, 2004).

Os efeitos das alteraes epigenticas no estorelacionados com mudanas na seqncia primriado DNA, mas sim com os mecanismos quecontrolam a expresso gnica, como o caso dametilao dos resduos de citosina, sendo uma dasexplicaes para as diferenas fenotpicas sutis queso observadas nos gmeos monozigticos ou nosindivduos clonados.

O estabelecimento dos padres de metilaoocorre na fase inicial do desenvolvimento e podese propagar pela vida toda, criando uma situaopeculiar, na qual caractersticas fenotpicascontroladas em nvel de genoma, no so passveisde serem herdadas.

Um dos fatores que exerce grande influnciano padro de metilao a disponibilidade celulardas vitaminas que participam do metabolismo deum-carbono (B6, B12 e cido flico), uma vez queo grupo metil utilizado no processo de metilaodo DNA originrio dessa via metablica.

Por outro lado, variaes genticas dentro deuma mesma populao fazem com que osindivduos respondam de forma diferente a umamesma dieta. o caso dos portadores degalactosemia ou de fenilcetonuria, duas doenascausadas por defeito gentico em um nico gene,que necessitam dietas isentas de lactose ou defenilalanina para poderem ter uma vida normal.

Este um exemplo cuja caracterstica feno-tpica controlada por um nico gene. Entretanto,existe considervel evidncia de que doenascrnicas, decorrentes de anomalias polignicas,possam estar associadas dieta. Hipercoles-

terolemia, aterosclerose, diabete tipo 2, obesidadee diversos tipos de cncer, so exemplos clssicos.

A diabete tipo 2 um modelo de estudointeressante, pois os genes regulados pela dietatem um papel central no seu desenvolvimento.Quando diagnosticados com essa doena, algunsindivduos conseguem controlar os seus sintomasapenas com o aumento da atividade fsica ereduo na ingesto de calorias, ou seja, controlama expresso da informao genmica pelamudana em variveis ambientais (a dieta). Joutros indivduos so totalmente refratrios a essetipo de controle e precisam ser tratados commedicamentos (Marti et al., 2005). De maneira quea identificao de alelos que contribuem para odesenvolvimento das doenas crnicas, de carterpolignico, um dos campos que tm recebidomais ateno dentro da genmica nutricionalhumana.

Assim sendo, verifica-se que as interaesentre os nutrientes e o genoma dos indivduosocorrem em diferentes etapas do processo deexpresso gnica, afetando tanto o transcriptoma,quanto o proteoma. No entanto, seus efeitos podemser monitorados e analisados pelas ferramentas degenmica funcional atualmente disponveis(Figura 1).

O genoma de uma espcie e as variaesgenticas que existem entre os indivduos dessaespcie so resultantes da adaptao s pressesevolucionrias a que ela foi submetida. Duranteesse processo, a nutrio talvez seja a varivelambiental mais persistente e, portanto, uma dasque mais contribui para moldar um genoma e suasvariaes (Stover, 2004).

Assim, considerando as diferenas que existementre os indivduos de uma mesma espcie, plausvel pensar que cada um possa reagir de formadiferente ao ser alimentado com a mesma dieta e,com o uso das ferramentas de genmica, est sendopossvel identificar e entender as bases genticasdessas diferenas, bem como analis-las dentro deum contexto populacional.

Os estudos de genmica nutricional na reaanimal ainda so incipientes, mas os exemplostomados da rea humana deixam claro que elessero de grande valia, notadamente para oaperfeioamento e evoluo das normas e padresde alimentao das diferentes espcies. De maneiraque ela dever redirecionar a nutrio animal para


340 Furlan et al.

uma abordagem mais personalizada, na qual asdietas das diferentes espcies sero adequadas emfuno da raa, linhagem, ou mesmo grupos deanimais com caractersticas semelhantes.

Literatura citada

BAILEY, J.E. Lessons from metabolic engineering for functionalgenomics and drug discovery. Nat. Biotechnol., v.17, p.616-18, 1999

CHEN, G.; GHARIB, T.G.; HUANG, C.C. et al. Discordantprotein and mRNA expression in lung adenocarcinomas. Mol.Cell. Proteomics, v.1, p.304-13, 2002.

ELLIOTT, R. & ONG, T.J. Science, medicine, and the future -Nutritional genomics. BMJ, v.324, p.1438-1442, 2007.

GERMAN, B. & YOUNG, V. R. Nutrition and Genomics. NestlNutrition Workshop Series Clinical & PerformanceProgram, v.9, p.243-263, 2004.

GRAVES, P.R. & HAYSTEAD, T.A.J. Molecular biologistsguide to proteomics. Microbiol. Mol. Biol. Rev., v.66, p. 39-

63, 2002.GREENBAUM, D.; LUSCOMB, N.M.; JANSEN, R. et al.

Interrelating different types of genomic data, from proteometo secretome: Oming in on function. Genome Res., v.11, p.1463-1468, 2001.

GYGI, S.P.; ROCHON, Y.; FRANZA, B.R. et al. Correlationbetween protein and mRNA abundance in yeast. Mol. Cell.Biol., v.19, p.1720-1730, 1999.

HIENDLEDER, S.; BAUERSACHS, S.; BOULESTEIX, A. etal. Functional genomics: tools for improving farm animalhealth and welfare. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., v.24, n.1,p. 354-377, 2005.

HOCQUETTE, J.F.; LEHNERT, S.; BARENDSE, W. et al.Recent advances in cattle functional genomics and theirapplication to beef quality. The International Journal ofAnimal Biosciences, v.1, p.159-173, 2007.

KAPUT, J. & RODRIGUEZ, R.L. Nutritional genomics: thenext frontier in the postgenomic era. Physiol. Genomics, v.16, p.166-177, 2004.

LANDER, E.S.; LINTON, L.M.; BIRREN, B. et al. Initialsequencing and analysis of the human genome. Nature, v.409, p. 860-921, 2001.

LEHNERT, S.A.; BYRNE, K.A.; REVERTE, A. et al. Gene

Figura 1 - Representao esquemtica dos passos envolvidos na expresso gnica (centro), estgios nosquais a dieta pode modular estes processos (esquerda), e as tcnicas de genmica funcional utilizadaspara analisar cada estgio (direita). (Extrado e modificado de Elliot & Ong, 2007).

Regulao pela dieta Processo deexpresso gnica

Tcnicas de genmicafuncional

Genmica (seqenciamento eidenficao de polimorfismos)DNA

Transcrio,processamento do

RNA

Transcriptmica(microarrays)RNA

Traduo,modificao de

protenas

Protemica(2D, MS/MS)Protena

Clula

Metablitos

Fentipo

Metabolmica


341A genmica funcional no mbito da produo animal: estado da arte e perspectivasexpression profiling of bovine skeletal muscle in response toand during recovery from chronic and severe undernutritionJ. Anim Sci., v.84, p.3239-3250, 2006.

LIU, L.; GONG, G.; LIU, Y. et al. Multi-species comparativemapping in silico using the COMPASS strategy.Bioinformatics, v.20, n.2, p.148-154, 2004.

LOOR, J.J.; DANN, H.M.; GURETZKY, N.A.J. et al. Plane ofnutrition prepartum alters hepatic gene expression andfunction in dairy cows as assessed by longitudinal transcriptand metabolic profiling. Physiol. Genomics, v.27, p.29-41,2007.

MARTI, A.; MORENO-ALIAGA, M.A.J.; ZULET M.A.A. etal. Avances en nutricin molecular: nutrigenmica y/onutrigentica. Nutr. Hosp., v.3, p.157-164, 2005.

MUTCH, D.M.; WAHLI, W.; WILLIAMSON, G.Nutrigenomics and nutrigenetics: the emerging faces ofnutrition. FASEB J., v.19, p.1602-16, 2005.

NEWMAN, A. RNA splicing. Curr. Biol., v.8, p.R903-R905,1998.

SANGER, F.; NICKLEN, S. & COULSON, A.R. DNAsequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nat.Acad. Sci., v.74, n.12, p.5463-5467, 1977.

SCHENA, M.; SHALON, D.; DAVIS, R.W. et al. Quantitative

monitoring of gene expression patterns with a complementaryDNA microarray. Science, v.270, n.5235, p.467-470, 1995.

SMITH, T.P.L.; GROSSE, W.M.; FREKING, B.A. et al.Sequence evaluation of four pooled-tissue normalized bovinecDNA libraries and construction of a gene index for cattle.Genome Research, v.11, p.626-630, 2001.

SONSTEGARD, T.S. & VAN TASSELL, C.P. Bovine genomicsupdate: making a cow jump over the moon. Genet. Res.,v.84, p.3-9, 2004.

STOVER, P.J. Nutritional genomics. Physiol. Genomics, v.16,p. 161-165, 2004.

SUCHYTA, S.P.; SIPKOVSKY, S.; KRUSKA, R. et al.Development and testing of a high-density cDNA microarrayresource for cattle. Physiol. Genomics, v.15, p.158-164.2003.

VENTER, J.C.; ADAMS, M.D.; MYERS, E.W. et al. Thesequence of the human genome. Science, v.291, p.1304-1351,2001.

WANG, H. & HANASH, S. Intact-protein based samplepreparation strategies for proteome analysis in combinationwith mass spectrometry. Mass. Spectrom. Rev., v.24, n.3, p.413-426, 2005.

a genômica funcional no Âmbito da produção animal

Documents