Resultados

Resultados 79

4. RESULTADOS

4.1. Resultados da determinação da atividade da enzima

pirazinamidase

Os resultados do teste de atividade da enzima pirazinamidase dos

isolados clínicos de M. tuberculosis estão apresentados na tabela 5. A figura

4 mostra resultados positivo e negativo do teste de atividade da PZase. A

tabela 6 mostra a correlação entre os resultados do teste de atividade de

PZase com o perfil de sensibilidade dos isolados clínicos de M. tuberculosis a

Z.

Figura 4. Foto do teste de atividade da PZase ilustrando o resultado após revelação com sulfato ferroso amoniacal a 1%. O tubo 1 contém a cepa M. avium ATCC 13950 utilizada como controle positivo; 2 contém o controle positivo do sistema onde há POA ao invés de Z; 3 contém o controle negativo; 4 contém um teste negativo; 5 e 6 contêm testes positivos, onde pode se observar uma banda rosa discreta na superfície do meio de cultivo.

1 2 3 4 5 6

Resultados 80

Tabela 5. Resultados do teste para determinação da atividade da enzima pirazinamidase dos isolados de M. tuberculosis com os respectivos controles.

Atividade de PZase Isolados 7 dias 14 dias

Perfil de sensibilidade à Z

M. avium ATCC 13950 + + / Controle Positivo POA + + /

Controle Negativo - - / H37Rv + + S 1264 + + S 23417 + + S 1118 + + S

3360/00 + + S 1235 + + S

2075/00 + + R 48-A NC NC R 71-A NC NC R 72-A NC NC R

2965/00 NC NC R 46-S NC NC R 4850 NC NC R 73-A - - R

23130 + + R 3224 + + R 15109 - - R 44-A - - R 49-A - - R 69-A - - R 71-C - - R 1137 - - R 5505 - - R MGA1 - - R MGA2 - - R MGA3 - - R

3614/00 - - R 1193/01 - - R 2130/00 - - R 2193/00 - - R 3543/00 - - R

Onde: (NC) indica ausência de crescimento do isolado; (+) indica resultado positivo; (-) indica resultado negativo; (S) indica sensível; e (R) indica resistente.

Resultados 81

Tabela 6. Correlação entre os resultados do teste de atividade da PZase e o perfil de sensibilidade dos isolados de M. tuberculosis.

Isolados Resistente a Z Sensível a Z Total

Pzase + 3 (15,8%) 5 (100,0%) 8 (33,3%)

Pzase - 16 (84,2%) 0 (00,0%) 16 (66,7%)

Total 19 (100,0%) 5 (100,0%) 24 (100,0%)

Como esperado, a cepa padrão H37Rv e os isolados clínicos de M.

tuberculosis 1264, 23417, 1118, 3360/00 e 1235, caracterizados como

susceptíveis à Z pelo método das proporções em meio Lowenstein-Jensen,

apresentaram resultado positivo para atividade da enzima pirazinamidase, ou

seja, estes têm a capacidade de hidrolisar a Z produzindo o seu metabólito

ativo, o ácido pirazinóico.

A maioria dos isolados clínicos de M. tuberculosis caracterizados

como resistentes à Z (84,2%) apresentaram, também como esperado,

resultado negativo para atividade da pirazinamidase. As exceções ocorreram

com 3 (15,8%) isolados, 2075/00, 23130 e 3224, que, apesar do fenótipo de

resistência à Z, apresentaram resultado POSITIVO para atividade da enzima

pirazinamidase.

Resultados 82

4.2. Resultados da determinação da Concentração Inibitória

Mínima (CIM) para Z

A CIM para Z dos isolados clínicos de M. tuberculosis foi

determinada através de três metodologias: Método em Microplaca utilizando

o Alamar Blue como agente revelador (MABA) (FRANZBLAU et al., 1998);

Método de Microdiluição em Caldo (BMM) (LEITE et al., 2000); e Método das

Proporções em Lowenstein-Jensen (L-J) (MORLOCK et al., 2000 modificado).

A tabela 7 apresenta os resultados das CIM de cada isolado clínico

pelos três métodos. Um esquema ilustrativo do teste da CIM pelo método de

MABA pode ser observado na figura 5.

Figura 5. Representação da CIM pelo método de MABA após revelação com o corante Alamar Blue®. Na coluna 10 (B a G) tem-se o controle de crescimento dos isolados clínicos de M. tuberculosis. Na coluna 11 foi realizado o controle de esterilidade do meio de cultivo. O isolado clínico de M. tuberculosis presente na posição B apresentou CIM > 1600 µg/mL; na C < 12,5 µg/mL; na D de 50 µg/mL; na E de 400 µg/mL; na F de 100 µg/mL e na G de 200µg/mL. Obs.: na posição C7 houve contaminação com isolado resistente a Z.

11 2 3 4 5 6 7 8 9 10

B

C

D

E

F

G

Resultados 83

Tabela 7. Resultados da Concentração Inibitória Mínima dos isolados clínicos de M. tuberculosis para as três metodologias utilizadas.

Isolados MABA BMM L-J H37Rv < 12,5 µg/mL < 12,5 µg/mL 12,5 µg/mL 1264 50 µg/mL NC 12,5 µg/mL 23417 < 12,5 µg/mL < 12,5 µg/mL 12,5 µg/mL 1118 50 µg/mL 50 µg/mL 12,5 µg/mL

3360/00 50 µg/mL < 12,5 µg/mL 12,5 µg/mL 1235 100 µg/mL < 12,5 µg/mL 12,5 µg/mL

2075/00 200 µg/mL 100 µg/mL 200 µg/mL 48-A NC NC NC 71-A NC NC NC 72-A NC NC NC

2965/00 NC NC NC 46-S NC NC NC 4850 NC 1600 µg/mL NC 73-A > 1600 µg/mL NC > 800 µg/mL

23130 > 1600 µg/mL 1600 µg/mL > 800 µg/mL 3224 > 1600 µg/mL 100 µg/mL 800 µg/mL 15109 > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL 44-A > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL 49-A 400 µg/mL 400 µg/mL 400 µg/mL 69-A > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL 71-C > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL 1137 > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL 5505 > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL

MGA 1 > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL MGA 2 > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL MGA 3 > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL

3614/00 > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL 1193/01 800 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL 2130/00 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL 2193/00 > 1600 µg/mL 1600 µg/mL > 800 µg/mL 3543/00 > 1600 µg/mL > 1600 µg/mL > 800 µg/mL

Onde: NC: ausência de crescimento do isolado; MABA: Método em microplaca utilizando o Alamar Blue como revelador; BMM: método de microdiluição em caldo; L-J: método das proporções em Lowenstein-Jensen.

O método das proporções em L-J foi utilizado como padrão de

referência quando da análise para associação entre os métodos.

Resultados 84

A observação dos resultados da CIM mostra que, na maioria dos

isolados, há uma boa associação entre as três metodologias empregadas.

Resultados discrepantes foram encontrados para os isolados 3224 e 2075/00,

que se mostraram sensíveis apenas pelo método BMM e resistentes pelos

demais.

Nota-se também que não foi possível a determinação da CIM

pelos métodos MABA e das proporções em L-J em 6 isolados clínicos dos

quais não se obteve crescimento; como também em 7 isolados clínicos pelo

método BMM.

4.3. Caracterização molecular dos isolados clínicos de M.

tuberculosis

A caracterização molecular dos isolados clínicos de M. tuberculosis

resistentes e susceptíveis à Z, através da técnica de “Spoligotyping”, foi

realizada pela Dra. Rosilene Fressatti Cardoso no Centers for Disease Control

and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, EUA. Cabe ressaltar que não foi

possível a realização desta metodologia com isolados clínicos 1137, 5505,

MGA 1, MGA 2 e MGA 3.

Os resultados obtidos mostram que os isolados apresentam perfis

de hibridação característicos de M. tuberculosis, ou seja, a ausência de

hibridização com os oligonucleotídeos dos espaçadores 33 a 36.

Resultados 85

A figura 6 mostra o filme de raio-X de uma membrana revelada

após reação de hibridização pela técnica de “Spoligotyping”.

Figura 6. Foto do filme de raio-X mostrando uma membrana revelada da reação de hibridação da técnica de “spoligotyping”. As linhas 1 a 18 contêm isolados que foram caracterizados como M. tuberculosis. As linhas 19, 20 e 21 contêm os três controles da técnica: controle negativo da PCR para o locus DR, M. tuberculosis H37Rv, e M. bovis, respectivamente.

Após análise dos resultados, os isolados clínicos de M.

tuberculosis, susceptíveis e resistentes à Z, puderam ser agrupados em 10

padrões diferentes de “Spoligotyping”, como pode ser observado na tabela 8.

Os 10 padrões encontrados foram denominados de A, B, C, D, E, F, G, H, I e

J.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

20 21

Resultados 86

Tabela 8. Padrões de “Spoligotyping” encontrados nos isolados clínicos de M. tuberculosis testados.

Isolados Origem “Spoligotyping” Padrões71-C Sorocaba 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 2 0 7 7 1 A 44-A Ribeirão Preto 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 2 0 7 7 1 A 71-A Ribeirão Preto 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 2 0 7 7 1 A 72-A Ribeirão Preto 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 2 0 7 7 1 A

1193/01 São Paulo 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 2 0 7 7 1 A 15109 Maringá 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 2 0 7 7 1 A 69-A Ribeirão Preto 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 2 0 7 7 1 A

3360/00 São Paulo 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 2 0 7 7 1 A 3543/00 São Paulo 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 2 0 7 7 1 A 2130/00 São Paulo 6 7 7 7 3 7 6 0 7 7 6 0 7 7 1 B

73-A Ribeirão Preto 6 7 7 7 3 7 6 0 7 7 6 0 7 7 1 B 3614/00 São Paulo 6 7 7 7 3 7 6 0 7 7 6 0 7 7 1 B 23130 Maringá 6 7 7 7 3 7 6 0 7 7 6 0 7 7 1 B 49-A Ribeirão Preto 7 7 7 7 7 7 6 0 7 7 6 0 7 7 1 C 1235 São Paulo 7 7 7 7 7 7 6 0 7 7 6 0 7 7 1 C 1118 São Paulo 7 7 7 7 7 7 6 0 7 7 6 0 7 7 1 C

2193/00 São Paulo 7 7 7 7 7 7 6 0 7 7 6 0 7 7 1 C 3224 Maringá 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 0 7 7 1 D 46-S Sorocaba 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 6 0 7 7 1 D

2965/00 São Paulo 7 7 7 7 5 7 7 7 7 7 6 0 5 7 1 E 2075/00 São Paulo 7 7 7 7 7 7 7 7 4 0 2 0 7 7 1 F

48-A Ribeirão Preto 7 7 7 7 7 7 6 0 7 7 6 0 7 3 1 G 1264 Maringá 7 7 7 7 7 7 6 0 7 5 6 0 7 7 1 H 4850 Sorocaba 6 7 7 7 7 7 0 0 1 7 6 0 7 7 1 I 23417 Maringá 3 7 7 7 7 7 6 0 7 7 6 0 7 7 1 J

Como pode ser observado, o padrão A foi o mais freqüente, tendo

sido encontrado em nove (36%) isolados de diferentes procedências. Os

padrões B e C foram encontrados em quatro (16%) isolados, o padrão D em

dois (8%) isolados, os padrões E, F, G, H, I e J em um (4%) isolado cada.

Resultados 87

4.4. Detecção de mutações no gene pncA em isolados clínicos

de M. tuberculosis

O gene pncA em toda a sua extensão, bem como 410 pb

“upstream” e 229 pb “downstream”, dos isolados clínicos de M. tuberculosis

e da cepa padrão H37Rv, foi amplificado pela técnica da PCR gerando um

produto com 1200 pb. Após purificação, os produtos da PCR foram

submetidos à reação de seqüenciamento utilizando-se, para isso, 6

oligonucleotídeos iniciadores (3 “sense” e 3 “antisense”) com a finalidade de

flanquear todo o gene e a sua provável região promotora para que as

mutações pudessem ser caracterizadas.

Os produtos da reação de seqüenciamento dos 6 oligonucleotídeos

iniciadores de cada isolado de M. tuberculosis foram então alinhados,

juntamente com a seqüência original do gene pncA da cepa padrão H37Rv

disponível no “GenBank” (BX 842578), com auxílio do programa ClustalX, e

a presença de mutações pode ser determinada. A ferramenta BLASTX foi

utilizada para a determinação da troca de aminoácidos na estrutura da

enzima PZase. Na figura 7 é mostrado um exemplo da troca de aminoácidos

detectada.

Resultados 88

gi|15609180|ref|NP_216559.1| pncA [Mycobacterium tuberculosis H37Rv] Length = 186 Score = 376 bits (966), Expect = e-103 Identities = 185/186 (99%), Positives = 185/186 (99%) Frame = -3 Query: 704 MRALIIVDVQNDFCEGGSLAVTGGAALARAISDYLAEAADYHHVVATKDFHIDPGDHFSG 525 MRALIIVDVQNDFCEGGSLAVTGGAALARAISDYLAEAADYHHVVATKDFHIDPGDHFSG Sbjct: 1 MRALIIVDVQNDFCEGGSLAVTGGAALARAISDYLAEAADYHHVVATKDFHIDPGDHFSG 60 Query: 524 TPDYSSSWPPHCVSGTPGADFHPSLDTSAIEAVFYTGAYTGAYSGFEGVDENGTPLLNWL 345 TPDYSSSWPPHCVSGTPGADFHPSLDTSAIEAVFY GAYTGAYSGFEGVDENGTPLLNWL Sbjct: 61 TPDYSSSWPPHCVSGTPGADFHPSLDTSAIEAVFYKGAYTGAYSGFEGVDENGTPLLNWL 120 Query: 344 RQRGVDEVDVVGIATDHCVRQTAEDAVRNGLATRVLVDLTAGVSADTTVAALEEMRTASV 165 RQRGVDEVDVVGIATDHCVRQTAEDAVRNGLATRVLVDLTAGVSADTTVAALEEMRTASV Sbjct: 121 RQRGVDEVDVVGIATDHCVRQTAEDAVRNGLATRVLVDLTAGVSADTTVAALEEMRTASV 180 Query: 164 ELVCSS 147 ELVCSS Sbjct: 181 ELVCSS 186

Figura 7. Exemplo de troca de aminoácidos na enzima PZase. A troca foi de K (Lisina) para T (Treonina) na posição 96 da enzima ocasionada pela troca do códon AAG por ACG.

Na figura 8 são mostrados os eletrofluorogramas de algumas das

mutações do gene pncA encontradas nos isolados clínicos de M. tuberculosis.

A tabela 8 mostra o resultado do seqüenciamento semi-

automático dos isolados clínicos de M. tuberculosis, bem como da cepa

padrão H37Rv, e indica as mutações encontradas que ainda não estavam

descritas na literatura.

Resultados 89

Figura 8. Ilustração de algumas mutações identificadas no gene pncA em isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes à Z.

M M

N

CCTTGGTTGCCACGACGTGATG

Deleção C

M

N

N

M: seqüência mutada N: seqüência normal

CGTCTGGCGCACACAATGATCG

Troca A G

ATCGGCCGACACACCCGCTGTC

Troca A G

GCATACGTCCACCATACGTTCG

Troca T C

M

N CCTTCGAAG-CCGCTGTACGCT

Inserção C

M

N

CCTTCGAAG-CCGCTGTACG

Inserção C

M

N

Resultados 90

Tabela 9. Resultado do seqüenciamento do gene pncA dos isolados clínicos de M. tuberculosis.

Mutações Isolados Códon Aminoácido

Referência

H37Rv - - - 1264 IS 6110 -30pb - Mutação nova 23417 - - - 1118 - - -

3360/00 - - - 1235 - - -

2075/00 - - - 48-A CTG > CCG L172P MORLOCK et al., 2000 71-A A > G -11pb - ESCALANTE et al., 1998 72-A A > G -11pb - ESCALANTE et al., 1998

2965/00 GAC > GGC D63G TRACEVSKA et al., 2004 46-S GTG > GCG V139A SREEVATSAN et al., 1997 4850 Deleção C 135 Frameshift Mutação nova 73-A TCC > CCC S59P BROWN et al., 2000

23130 - - - 3224 - - - 15109 TCG > CCG S164P Mutação nova 44-A Inserção C 314 Frameshift Mutação nova* 71-C Inserção C 314 Frameshift Mutação nova* 49-A Inserção C 495 Frameshift Mutação nova 69-A AAG > ACG K96T LEMAITRE et al., 1999 1137 CTG > CGG L120R Mutação nova 5505 Deleção Total Deleção Total SUZUKI et al., 2002

MGA 1 CAC > CGC H57R SUZUKI et al., 2002 MGA 2 TGG > TTG W68F Mutação nova* MGA 3 TGG > TTG W68F Mutação nova*

3614/00 GTG > GGG V155E Mutação nova 1193/01 ATT > AGT I133S Mutação nova 2130/00 CCG > CAG P54Q Mutação nova 2193/00 CAC > CGC H51R ESCALANTE et al., 1998 3543/00 GCG > CCG A3P LEMAITRE et al., 1999

* Dois isolados (44-A e 71-C; MGA 2 E MGA 3) apresentaram a mesma mutação, que ainda não foi descrita na literatura.

Dentre as 22 mutações encontradas neste estudo, 9 ainda não

haviam sido descritas na literatura. Cabe ressaltar que a seqüência de

inserção IS6110 encontrada na posição -30 pb em relação ao gene pncA no

Resultados 91

isolado clínico 1264 não interferiu no perfil de sensibilidade à Z do mesmo,

uma vez que não ocorreu na provável região promotora do gene mas,

provavelmente, em uma região intergênica. Em vista disto, esta mutação foi

desconsiderada.

O gene pncA do isolado clínico 5505 não pôde ser amplificado pela

PCR e, uma vez que se trata de uma cepa de M. tuberculosis, deduziu-se que

pode ter ocorrido uma deleção, se não total, de um fragmento grande do

gene, que levou ao fenótipo de resistência à Z e ausência de atividade da

enzima PZase.

A figura 9 mostra a distribuição das mutações encontradas neste

estudo ao longo dos 186 aminoácidos que compõe a enzima PZase, bem

como na sua provável região promotora.

Figura 9. Representação esquemática da distribuição das mutações no gene pncA, detectadas no presente estudo, ao longo da enzima PZase.

186

-11

pb A G

GCG

CCG

CAC CGC

CCG CAG

CAC CG

C TCC CCC G

AC GG

C

TGG

TTG

AAG ACG

In

s C1

05

CTG CG

G

ATT AGT

∆ C4

5

GTG

GCG

G

TG G

GG

TCG CCG

In

s C1

65

CTG CCG

1

A3 P

H51R

P54Q

H57R

S59P

D63G

W68 F K96T L120R

I133S V139A

V155E

S164P

L172P

Mutações novas

Dois isolados

Resultados 92

Vários autores apontaram as posições 3 a 17, 61 a 76, 132 a 142

e a posição -11 na provável região promotora do gene como sendo as

regiões de maior freqüência de mutação (SCORPIO et al., 1997a;

SREEVATSAN et al., 1997; ESCALANTE et al., 1998; LEMAITRE et al., 1999;

MARTILLA et al., 1999; MESTDAGH et al., 1999; CHENG et al., 2000;

MORLOCK et al., 2000; PARK et al., 2001). No presente estudo, 4,8% das

mutações encontradas ocorreram nas posições 3 a 17, 9,5% nas posições 61

a 76, 9,5% nas posições 132 a 142, e 9,5% na posição -11. O restante das

mutações (66,7%) ocorreram em outras posições do gene, sendo que 23,8%

ocorreram nas posições 45 a 59 e 19% nas posições 155 a 172, mostrando

uma discordância dos dados até agora encontrados na literatura.

4.5. Avaliação da associação entre as mutações no gene

pncA, resistência à Z e atividade de PZase em isolados clínicos

de M. tuberculosis

A tabela 9 mostra o número total de isolados clínicos de M.

tuberculosis susceptíveis e resistentes à Z, e sua relação com a presença de

mutações no gene pncA.

A ausência de mutações no gene pncA correlacionou-se bem com

o fenótipo de sensibilidade à Z nos isolados de M. tuberculosis uma vez que

Resultados 93

os 5 cinco isolados clínicos sensíveis à Z não apresentaram mutação no gene

pncA bem como em sua provável região promotora.

Tabela 10. Relação entre resistência à Z e presença de mutações no gene pncA.

Isolados Sensíveis Resistentes Total

Sem mutação 5 (100,0%) 3 (12,0%) 8 (26,7%)

Com mutação 0 (00,0%) 22 (88,0%) 22 (73,3%)

Total 5 (100,0%) 25 (100,0%) 30 (100,0%)

No entanto, pode-se observar que 3 (12%) isolados clínicos de M.

tuberculosis caracterizados como resistentes à Z não apresentaram nenhuma

alteração no gene pncA, bem como em sua provável região promotora. Este

fato sugere a presença de outro mecanismo conferindo o fenótipo de

resistência à Z. Nota-se, também, que a maioria dos isolados clínicos de M.

tuberculosis resistentes à Z (88%) apresentaram mutações no gene pncA,

sendo este o principal mecanismo de resistência encontrado neste trabalho.

Pode-se avaliar também a correlação entre a presença de

mutações no gene pncA nos isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes à

Z com a atividade da enzima PZase, como pode ser verificado na tabela 10.

Neste caso podemos observar que os 3 (15,8%) isolados clínicos

de M. tuberculosis resistentes à Z que não apresentaram mutação no gene

pncA possuem atividade da enzima PZase, enquanto que os 16 (84,2%)

Resultados 94

isolados resistentes que apresentaram o gene pncA mutado não possuem a

enzima PZase ativa.

Tabela 11. Correlação entre a presença de mutações no gene pncA e atividade da enzima PZase nos isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes à Z.

Isolados Resistentes Sem mutação Com mutação Total

PZase Positiva 3 (15,8%) 0 (00,0%) 3 (15,8%)

PZase Negativa 0 (00,0%) 16 (84,2%) 16 (84,2%)

Total 3 (15,8%) 16 (84,2%) 19 (100,0%)

4.6. Avaliação da presença de isolados clínicos de M.

tuberculosis resistentes somente à Z

Como pode ser visto no anexo 1, dentre os 25 isolados clínicos de

M. tuberculosis resistentes analisados neste estudo, 5 eram resistentes

somente à Z. Este fato é de suma importância, considerando-se que a

monorresistência à Z era tida como exclusividade da espécie M. bovis, sendo

inclusive utilizada na sua identificação. A tabela 11 mostra os 5 isolados

resistentes somente a Z e algumas de suas características.

Resultados 95

Tabela 12. Resultados do teste de atividade da PZase e mutações encontradas nos isolados clínicos de M. tuberculosis que apresentaram monorresistência à Z.

Monorresistentes PZase Mutações

3224 + -

5505 - Deleção Total

MGA 1 - H57R

MGA 2 - W68L

MGA 3 - W68L

Dos 5 isolados clínicos de M. tuberculosis monorresistentes à Z, 4

apresentaram mutação no gene pncA e ausência de atividade da enzima

PZase. Nota-se, no entanto, que um dos isolados clínicos (3224) apresentou

atividade enzimática e ausência de mutações no gene pncA, devendo sua

monorresistência estar associada a outro mecanismo ainda desconhecido.