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5 Resultados: desenvolvimento de mtodos para determinao indireta da amitriptilina

No presente captulo sero apresentados e discutidos os procedimentos

realizados para a derivatizao fotoqumica da amitriptilina (AMT), uma

substncia utilizada em medicamentos antidepressivos, e a aplicao desta

abordagem para o desenvolvimento de um mtodo espectrofluorimtrico para a

anlise de medicamentos com o princpio ativo AMT e um mtodo usando a

cromatografia lquida com deteco fluorimtrica para a determinao indireta de

AMT em matrizes mais complexas como soro humano.

5.1. Desenvolvimento de mtodo espectrofluorimtrico para determinao indireta de AMT

5.1.1. Estudos preliminares

A AMT, comercializada em medicamentos e no padro analtico na forma

de cloridrato, altamente solvel em gua. Em funo disso, as solues

estoque do padro do analito e as diluies necessrias foram feitas usando

gua ultrapura.

A AMT composta por trs anis sendo dois anis benznicos e um outro

anel de 7 carbonos, alm de uma cadeia aliftica com uma amina terciria

terminal. Os anis benznicos so isolados, cada um de um lado do ciclo de 7

membros, mas apesar disso, h uma conjugao mediada pela dupla ligao da

cadeia aliftica. Contudo, o conjugao entre os orbitais no perfeita devido a

presena do ciclo de 7 membros, que dificulta a deslocalizao da nuvem

eletrnica. Apesar da estrutura com os anis ligados propiciarem uma certa

rigidez molcula, a ramificao aliftica da AMT causa perdas energticas por

mecanismos no-radiativos diminuindo consideravelmente a capacidade da

molcula fluorescer na temperatura ambiente e em soluo. Isso confirmado

pela ausncia de fluorescncia natural da AMT quando em soluo aquosa na

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temperatura ambiente, como mostrado na Figura 26, onde se tem apenas a

fluorescncia caracterstica das impurezas da gua usada no experimento.

Figura 26 - Espectro de fluorescncia obtida da gua e da soluo aquosa de AMT (1,0 x 10

-5 mol L

-1).

A capacidade da AMT em absorver radiao fundamentalmente funo

da presena dos anis benznicos isolados como se verifica pelas bandas

caractersticas E2 (em 205 nm) e B (em 240 nm) do espectro de absoro

molecular da AMT (1,0 x10-5 mol L-1) (Figura 27). Esse espectro tambm

confirma a fraca conjugao efetiva do sistema de anis j que no foi

observado deslocamento batocrmico dos mximos das bandas caractersticas

do benzeno. Os valores das absortividades molares da AMT em gua nos

comprimentos de onda 205 e 240 nm foram calculados pela curva analtica feita

com os sinais de absorvncia na faixa de concentrao de AMT entre 5,0 x 10-6

e 2,5 x 10-5 mol L-1, obtendo-se valores iguais a 3,1 x104 L mol-1 cm-1 (205 nm) e

1,0 x104 L mol-1 cm-1 (240 nm).

Figura 27 - Espectro de absoro molecular da AMT (1,0 x10-5

mol L-1

, 100% gua)

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Na molcula da AMT, a eliminao da cadeia aliftica poderia gerar

estruturas mais rgidas que favoreceriam a observao de fluorescncia j que a

ausncia da cadeia diminuiria grandemente o grau de vibrao da molcula. Tal

eliminao poderia ser obtida por fotlise como indicado na literatura (Borell,

1977; Albini e Germani, 2010), sendo assim, foram realizados experimentos para

avaliar o efeito da exposio da AMT radiao UV em meios aquosos de

diferentes composies. Para tal, realizou-se a exposio ao UV (45 min) de

solues de AMT (1,0 x 10-5 mol L-1) preparadas nos seguintes meios reacionais:

(i) HCl 0,01 mol L-1; (ii) tampo fosfato pH 3 (0,01 mol L-1); (iii) tampo fosfato

(pH 5; 0,01 mol L-1); (iv) 100% gua ultrapura (pH 7); (v) tampo carbonato (pH

10; 0,01 mol L-1); e (vi) NaOH 0,01 mol L-1. O valor de 45 min para o tempo de

irradiao (no reator fotoqumico I) foi escolhido baseado na experincia prvia

dos estudos preliminares para a derivatizao da TBZ.

Vale salientar que a fluorescncia medida da soluo de AMT preparada

nos meios aquosos mencionados foi similar observada nas solues dos

respectivos brancos, com espectros de excitao e de emisso similares aos da

Figura 26. Em contrapartida, aps a exposio ao UV, observou-se a induo de

fluorescncia em todas as solues testadas em dois pares de bandas de

fluorescncia cujos mximos caractersticos de exc/ em foram em 233/345 nm e

em 263/325 nm. As intensidades relativas destes pares, que variaram em funo

da composio do meio de reao, so mostradas no grfico de barras da Figura

28.

Figura 28 - Fluorescncia de solues de AMT (1,0 x 10-5

mol L-1

) preparadas em distintos meios de reao aps exposio ao UV (45 min) e monitorada nos pares de excitao e de emisso de 233/345 nm e 263/325 nm.

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Observou-se que aps a irradiao com o UV, a tendncia do aumento da

fluorescncia do analito foi mais favorvel nas condies mais extremas de

acidez (HCl 0,01 mol L-1) e de basicidade (NaOH 0,01 mol L-1). Os espectros de

excitao e de emisso do fotoderivado preparados nessas duas condies,

aps 45 min de irradiao com UV, so apresentados na Figura 29. Para

medio da fluorescncia destas solues, que foi bastante intensa, foi

necessria utilizao de filtro de atenuao (de 50% de transmitncia medida a

632,8 nm25, com um fator 75 vezes de atenuao da fluorescncia na faixa entre

300 e 350 nm) na entrada do monocromador de emisso de modo a se evitar a

saturao do sinal no detector.

Figura 29 - Espectros de excitao e de emisso de solues de AMT 1,0 x 10-5

mol L-1

nos meios reacionais: (a) HCl 0,01 mol L

-1 e (b) NaOH 0,01 mol L

-1 aps 45 min de

irradiao com UV.

importante observar tambm que em meio alcalino a intensidade do par

de bandas em 263/325 nm maior que o par em 233/345 nm, aps a irradiao

da soluo de AMT por 45 min. Neste caso, o aumento de fluorescncia em

relao ao da soluo no tratada com UV de mais de 22 vezes. J em meio

cido, utilizando o mesmo tempo de UV, a formao da fluorescncia no par de

233/345 nm foi o mais favorecido aps a fotoderivatizao da AMT (Ifinal), com

amplificao de sinal em quase 35 vezes em relao ao medido antes da

25

Conforme as informaes fornecidas pelo fabricante (Newport, EUA)

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exposio ao UV (Iinicial). Esses fatores de amplificaes da fluorescncia,

mesmo em condies no otimizadas, mostram o potencial da derivatizao

fotoqumica para a determinao da AMT. Os fatores de amplificao de

fluorescncia (Ifinal/Iinicial) obtidos nas condies de cada experimento so

mostradas na Tabela 11.

Tabela 11 - Razes entre intensidade de sinal aps tratamento fotoqumico (Ifinal) e antes tratamento fotoqumico para a AMT (Iinicial), nos pares de excitao/ emisso 233/345 nm e 263/325 nm.

Ifinal / Iinicial

Meio de reao/( exc/ em ) 233/345 nm 263/325 nm

HCl 0,01 mol L-1

22,17 8,13 Tampo fosfato pH 3 12,60 7,96 Tampo fosfato pH 5 11,30 13,78 100% gua 11,99 13,92 Tampo bicarbonato pH 10 14,03 20,58 NaOH 0,01 mol L

-1 19,59 34,95

A estabilidade da fluorescncia da soluo de AMT exposta ao UV foi

estudada pelo monitoramento do sinal ao longo de 120 min (medies feitas a

cada 5 min) aps a exposio ao UV por 45 min. No intervalo entre cada

medio, a soluo foi mantida no escuro e na temperatura ambiente. Essa

avaliao se faz necessrio nesta etapa preliminar para se averiguar se a

fluorescncia do fotoderivado obtido estvel o suficiente para o

desenvolvimento de um mtodo analtico para determinao indireta de AMT

aps derivatizao fotoqumica. O teste de estabilidade foi realizado

primeiramente na soluo da AMT preparada em NaOH 0,01 mol L-1,

acompanhando o sinal em 263/325 nm, que o exc/ em caracterstico do(s)

fotoproduto(s) que produziu(ram) maior sinal nessa condio. Os resultados

apontaram para um decrscimo de fluorescncia do fotoderivado de at 25%

durante o perodo do teste, o que indica falta de estabilidade desse(s) produto(s)

em meio bsico. O mesmo estudo foi realizado em uma soluo do fotoderivado

da AMT preparada em HCl 0,01 mol L-1, monitorando o sinal em 233/345 nm,

que o exc/ em caracterstico do(s) fotoproduto(s) que produziu(ram) maior sinal

nessa condio. Nesse caso, a intensidade da fluorescncia foi estvel ao longo

dos 120 min do experimento. Os resultados so mostrados na Figura 30. Dessa

forma, a fluorescncia (233/345 nm) do(s) fotoderivado(s) obtidos em HCl 0,01

mol L-1 permaneceu estvel durante o tempo suficiente para permitir seu uso do

ponto de vista analtico da determinao de AMT. Assim, foram otimizadas as

condies experimentais relacionadas concentrao do HCl na soluo de

AMT e o tempo de exposio da soluo ao UV.

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Figura 30 - Fluorescncia da AMT (AMT 1,0 x 10-5

mol L-1

) monitorada entre 0 e 120 min aps derivatizao fotoqumica (45 min UV) em a) HCl 0,01 mol L

-1 (233/345 nm) e b)

NaOH 0,01 mol L-1

(263/325 nm).

5.1.2. Otimizao de parmetros experimentais para a derivatizao fotoqumica

Um estudo univariado para avaliar o comportamento da fluorescncia

induzida da AMT em funo da variao da concentrao do cido (HCl na faixa

entre 0 e 0,5 mol L-1) foi realizado. Com 45 min de exposio ao UV, observou-

se um crescimento significativo da intensidade da fluorescncia da soluo de

AMT em funo do aumento da concentrao de HCl at 0,1 mol L-1. O aumento

da concentrao de HCl para 0,2 mol L-1 promoveu a supresso da fluorescncia

de 25%, ao comparar o sinal com o obtido em soluo irradiada sem adio de

cido. A supresso se torna mais efetiva em concentraes maiores de HCl na

soluo (Figura 31).

Figura 31 - Efeito da concentrao de HCl na fluorescncia de solues aquosas de AMT (1,0 x 10

-5 mol L

-1) irradiadas por 45 min

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A influncia do tempo de exposio ao UV tambm foi avaliada. Para tal, a

fluorescncia da AMT (1,0 x 10-5 mol L-1; HCl 0,1 mol L-1) foi medida aps expor

irradiao UV solues de AMT, em intervalos de 5 min at o tempo final de 70

min (Figura 32). Como resultado, verificou-se um perfil de aumento de sinal,

aparentemente em duas etapas com sinal mximo e praticamente estvel entre

60 e 70 min de exposio ao UV.

Figura 32 - Efeito do tempo de exposio ao UV na intensidade de fluorescncia de solues de AMT (1,0 x 10

-5 mol L

-1) preparadas em soluo aquosa de HCl 0,1 mol L

-1

Para a otimizao das condies de derivatizao fotoqumica da AMT

usando planejamento experimental, concentraes menores de analito (1,0 x 10-

6 mol L-1) foram usadas visto que nos estudos preliminares, para a medio de

alguns dos sinais na concentrao de 1,0 x 10-5 mol L-1 de AMT necessitaram o

uso do filtro de atenuao e correo de valores medidos (valores acima de

1000 u.a.). Por causa de defeitos e no homogeneidade dos filtros, o uso destes

em ensaios de otimizao pode distorcer levemente o perfil de resposta em

relao aos sinais medidos sem o uso do filtro de atenuao.

Para avaliar os efeitos das variveis experimentais, e as possveis interaes, um planejamento experimental preliminar do tipo CCD 2

2 foi realizado utilizando os intervalos

de concentrao de HCl e de tempo de UV nos quais foram observadas maiores mudanas na fluorescncia da AMT nos estudos univariados. Mediante a avaliao do diagrama de contorno deste desenho experimental preliminar (Anexo C), pode ser observada a regio onde, ao variar as duas variveis ao mesmo tempo, efetivamente se observa um maior aumento da fluorescncia da AMT. Assim, utilizando essas informaes, um outro planejamento experimental foi realizado no intervalo de concentrao de HCl entre 0,01 e 0,058 mol L

-1 com tempos de exposio ao UV entre

46 e 74 min, conforme os valores indicados na

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Tabela 12.

Tabela 12 - Pontos experimentais do CCD para a optimizao das variveis de derivatizao fotoqumica (concentrao de HCl e tempo de UV) da AMT.

Parmetro / Valores codificados -2 -1 0 +1 +2

Concentrao de HCl (mol L-1

) 0,009 0,010 0,030 0,050 0,058 Tempo de UV (min) 46 50 60 70 74

Os experimentos foram realizados em ordem aleatria, conforme apontado

pelo software especializado constituindo de um experimento por cada ponto do

planejamento, e quatro rplicas no ponto central. Os resultados so mostrados

na Tabela 13.

Tabela 13 - Resultados experimentais (intensidade de fluorescncia) obtidos na otimizao dos parmetros de derivatizao fotoqumica da AMT pelo planejamento experimental (CCD) indicado na Tabela 13.

# Concentrao de HCl (mol L

-1)

Tempo de exposio ao UV (min)

Intensidade do sinal (u.a.)

1 0,058 60 215,04 2 0,010 70 201,39 3 0,030 74 224,51 4 0,030 60 279,37 5 0,009 60 230,93 6 0,030 60 308,47 7 0,050 50 230,06 8 0,010 50 257,54 9 0,030 46 164,61 10 0,030 60 284,86 11 0,050 70 168,56

Avaliando os resultados atravs da superfcie de resposta, o modelo

aponta para um mximo das variveis testadas (valores timos ou crticos) em

uma concentrao de HCl e tempo de irradiao UV prximo ao ponto central do

desenho experimental realizado, conforme indicado na Figura 33a. O grfico de

Pareto (Figura 33b) aponta que o fator quadrtico do tempo de irradiao (t2) foi

mais significante para o aumento da fluorescncia da AMT. J o efeito de

interao entre o tempo de reao e a concentrao de HCl no foi significativo,

na faixa experimentai testada.

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Figura 33 - a) superfcie de resposta e b) grfico de Pareto do CCD realizado para a otimizao das variveis de fotoderivatizao da AMT (C: concentrao de HCl, mol L

-1 ;

t: tempo de UV, min).

A equao do modelo matemtico que descreve os resultados do desenho

experimental realizado para a otimizao das variveis para a determinao

indireta da AMT (Equao 21), onde I a intensidade da fluorescncia da AMT,

C a concentrao de HCl em mol L-1 e t o tempo de irradiao UV, em min.

I = -20,7C -64,8C2 8,2t 93,3t2 2,67 Ct; R2 = 0,73 (21)

A anlise de varincia desse modelo no apontou para uma falta de ajuste

significativo (Fcalculado = 7,32 < Fcrtico = 9,55) e explica at 98% da varincia dos

dados, segundo o mostrado na Tabela 14.

Tabela 14 - Anlise de varincia dos resultados do planejamento experimental CCD para a otimizao das variveis de derivatizao fotoqumica da AMT.

Fator SQ Gl MQ F P

C 856,60 1 856,60 3,50911 0,201899 C

2 5935,53 1 5935,53 24,31508 0,038752

T 135,62 1 135,62 0,55557 0,533744 T

2 12280,26 1 12280,26 50,30644 0,019304

C x t 7,16 1 7,16 0,02931 0,879813 Falta de ajuste 5360,79 3 1786,93 7,32021 0,122555

Erro puro 488,22 2 244,11

SQ total 21291,49 10

% varincia explicada 73%

% mximo de varincia explicada* 98%

Onde C a concentrao de HCl, t o tempo de irradiao, SQ = soma quadrtica, gl = graus de liberdade; MQ = media quadrtica . *% max = (SQTotal SQerro puro)/ SQ total

A resoluo da Equao 21 apontou para valores crticos (timos) de:

0,027 mol L-1 (na prtica 0,03 mol L-1) para a concentrao de HCl na soluo de

AMT e 60 min para o tempo de exposio ao UV. Um experimento de

derivatizao da AMT (1,0 x 10-6 mol L-1; n = 3) na condio otimizada foi

realizado para confirmao dos resultados apontados para os valores crticos.

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Um espectro de excitao e de emisso da fluorescncia medida da

soluo de AMT, antes e aps aplicao das condies otimizadas de

derivatizao fotoqumica, so apresentados na Figura 34. Observa-se o

incremento de 5,6 vezes da fluorescncia medida da soluo de AMT aps

aplicao do procedimento de derivatizao fotoqumica. importante salientar

que a fluorescncia medida da soluo de AMT antes da exposio ao UV

igual ao perfil do ensaio do branco. Adicionalmente, observou-se um perfil de

fluorescncia do ensaio de branco similar antes e aps a exposio ao UV.

Figura 34 - Espectro de excitao e de emisso: a) fotoderivado (AMT 1,0 x 10-6

mol L-1

;

HCl 0,03 mol L-1

; 60 min de irradiao UV) e b) AMT (1,0 x 10-6

mol L-1

; 100% gua).

Um resumo das condies experimentais otimizadas para a determinao

indireta da AMT por espectrofotometria de fluorescncia por derivatizao

fotoqumica apresentado na Tabela 15. Estas condies experimentais foram

utilizadas para as etapas de validao e aplicao do mtodo.

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Tabela 15 - Resumo das condies experimentais para a determinao indireta da fluorescncia da AMT aps a derivatizao fotoqumica

Parmetro Condio otimizada

Meio de reao (solvente) HCl 0,03 mol L-1

Tempo de irradiao UV 60 min

Comprimentos de onda de excitao/emisso 233/345 nm

Velocidade de varredura 1500 nm min-1

Bandas espectrais de passagem (excitao/emisso) 15/15 nm

5.1.3. Estudo de estabilidade de fluorescncia e mecanismo da fotoderivatizao

A estabilidade da fluorescncia medida da soluo de AMT aps a

derivatizao fotoqumica em condies otimizadas foi avaliada medindo (i) a

intensidade da fluorescncia sob irradiao incidente contnua (30 min) da fonte

de excitao de xennio do espectrofluormetro e (ii) a intensidade da

fluorescncia medida em intervalos de 5 min at 90 min de uma soluo aps

ser submetida ao procedimento de derivatizao fotoqumica.

A estabilidade da fluorescncia em condies de exposio contnua

radiao de excitao do espectrofluormetro foi realizada em solues aquosas

de AMT, sendo uma delas preparada em HCl 0,03 mol L-1 e previamente

submetida ao procedimento de derivatizao fotoqumica e a outra, preparada

em gua ultrapura e no exposta ao UV previamente sua colocao no

compartimento de amostra do espectrofluormetro. Na Figura 35 observou-se

que a fluorescncia de ambas as solues permaneceu estvel durante o

perodo do experimento. Portanto, para a determinao indireta da AMT no h

influncia do tempo de incio da medio aps derivatizao fotoqumica nem

fotoderivatizao da soluo no compartimento de amostra. No caso da soluo

no exposta previamente ao UV, verificou-se que a radincia da fonte de

excitao e as condies da soluo no foram suficientes para desencadear

reao fotoqumica relevante na soluo de AMT.

A estabilidade do sinal analtico um fator importante nos procedimentos

de derivatizao fotoqumica com objetivos analticos. A medio da

fluorescncia da AMT (1,0 x 10-6 mol L-1) aps a derivatizao fotoqumica (HCl

0,03 mol L-1, 60 min de UV) foi realizada em intervalos de 5 min at completar 90

min. Nos intervalos entre medies, a soluo foi mantida em um compartimento

fechado e protegido da luz e lambada de xennio foi desligada. Nesse caso, no

foi observada mudana significativa na fluorescncia do fotoderivado (Figura 36).

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A variao de sinal foi aleatria e o coeficiente de variao obtido das medies

ao longo dos 90 min foi de 1,2%.

Figura 35 - Avaliao da estabilidade: a) fotoderivado (AMT 1,0 x 10-6

mol L-1

; HCl 0,03 mol L

-1; 60 min UV) e b) AMT (AMT 1,0 x 10

-6 mol L

-1 ; 100 % gua) sob irradiao

incidente contnua.

Figura 36 - Avaliao da estabilidade da fluorescncia da AMT (1,0 x 10-6

mol L-1)

em condies otimizadas de derivatizao (HCl 0,03 mol L

-1 ; 60 min UV), medida sob

irradiao descontnua, em intervalos de 5 min aps a reao fotoqumica.

Para a identificao do mecanismo de reao e para propor a estrutura

dos fotoderivados sintetizados na derivatizao fotoqumica da AMT foram

consideradas: (i) as condies utilizadas para promover a reao e (ii) a

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evidncia do aumento da intensidade de fluorescncia obtido experimentalmente

com a derivatizao.

No primeiro caso, a reviso bibliogrfica indica que o mecanismo de

reao mais favorvel para gerao de produtos fluorescentes, utilizando

lmpadas de mercrio de baixa presso e meio aquoso, a fotlise. No segundo

caso, pelo aumento de fluorescncia, afirma-se que os fotoprodutos possuem

maior eficincia quntica que a AMT, propriedade essa que, em molculas

orgnicas causada por uma maior rigidez estrutural ou uma maior conjugao

de eltrons . Dessa forma, avaliando a reao de fotlise e a formao de

fotoprodutos com maior rigidez estrutural e/ou conjugao de eltrons , o

esquema de reao para a derivatizao fotoqumica da AMT proposto na

Figura 37.

Figura 37 - Esquema de reao proposto para a fotoderivatizao da AMT em condies otimizadas (HCl 0,03 mol L

-1 irradiada por 60 min).

Estima-se que a formao dos fotoprodutos ocorra em duas etapas: (i) a

eliminao do grupo amino da molcula da AMT (277 Da), para gerar uma

molcula com uma cadeia aliftica (236 Da), cujas insaturaes se conjugam

com resto do sistema aromtico da molcula e (ii) outra reao na cadeia

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aliftica insaturada do produto de 232 Da, causando outra fotlise na molcula e

a formao do fotoderivado com 206 Da. Embora esta rota no seja a nica para

formao de produtos de reao, as molculas apontadas no mecanismo, com

de 232 ou 206 Da, possuem maior rigidez estrutural e alta conjugao de

eltrons , responsveis pelo aumento de fluorescncia observado nas

medies espectrofluorimtricas realizadas aps a derivatizao fotoqumica da

AMT.

Na tentativa de identificar estes fotoprodutos, anlises foram realizadas por

cromatografia gasosa com deteco por espectrometria de massas (GC-MS).

Solues de 2,5 g g-1 de AMT (9,6 x 10-6 mol L-1) foram preparadas em

acetonitrila e irradiadas em intervalos de 0 a 30 min, para monitorar e identificar

os fotoprodutos e a cintica de reao26. Na Figura 38 apresentado o

cromatograma de uma soluo de AMT irradiada por 30 min. Observa-se que no

tempo de reteno de 21,96 min, aparece o on molecular da AMT (m/z 277 Da)

e nos tempos de reteno de 18,81 e 18,08 min aparecem, respectivamente,

dois fotoderivados de 232 e 206 Da, massas molares essas atribudas aos

fotoprodutos propostos no mecanismo de fotoderivatizao da AMT

anteriormente descrito.

Figura 38 - Cromatograma de ons totais de uma soluo de AMT (9,6 x 10-6

mol L-1

; 100% acetonitrila) aps 30 min de UV.

26

Devido incompatibilidade da tcnica de GC-MS com o meio aquoso, optou-se por realizar a reao fotoqumica da AMT em 100% de acetonitrila, comparando previamente por espectrofluorimetria a eficincia da reao (intensidade) e os comprimentos de onda, similares em ambos solventes.

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O espectro de massas de cada on do cromatograma anterior se

encontram na Figura 39. No espectro que corresponde a AMT (Figura 39a)

pode-se observar um pico em m/z 58 Da, j caracterizado anteriormente em

outros trabalhos (Rani et al., 2011; Papoutsis et al., 2002; Ito et al., 2011). Nos

outros dois espectros da Figura 39, os ons com maior abundancia relativa so,

respectivamente, os ons de 206 e 232 Da, caractersticos das estruturas

propostas no mecanismo reacional.

Figura 39 - Espectros de massas de uma soluo de AMT (9,6 x 10-6

mol L-1

; 100% acetonitrila) por 30 min: (a) AMT ; (b) fotoderivado de 206 Da e (c) fotoderivado de 232 Da.

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Com o intuito de estudar a cintica de reao e a proporo em que os

fotoderivados se formam aps exposio da soluo da AMT ao UV, a rea do

pico de cada um dos compostos foi monitorada aps a irradiao de AMT entre 0

e 30 min. A AMT foi monitorada no pico de m/z 58 Da, enquanto que os

fotoderivados nos picos de m/z 206 e 232 Da (Figura 40a). Pode ser constatado

que a reao fotoqumica ocorre em duas etapas: (i) pela a fotlise da AMT e (ii)

a pela formao dos fotoprodutos a partir de 10 min de reao no caso do em

m/z 232 Da, e somente aps 30 min de UV no caso do on com m/z 206 Da. Ao

graficar o logaritmo natural das reas do pico majoritrio da AMT, ln(A), durante

o tempo de irradiao da molcula, t, entre 0 e 30 min, foi determinado que a

fotlise da AMT segue uma cintica de reao de primeira ordem, ln(A) = ln(Ao)

+ kt, com a constante de reao de k, determinada como sendo -0,097 min-1 ,

como mostra a Figura 40b.

Figura 40 - (a) Formao dos fotoderivados da AMT monitorada pela rea de pico em funo do tempo de irradiao e (b) cintica de reao de fotlise da AMT na derivatizao fotoqumica.

5.1.4. Parmetros analticos de mrito

A relao entre a concentrao de AMT e a intensidade de fluorescncia

aps a reao fotoqumica em condies otimizadas (HCl 0,03 mol L-1 e 60 min

de exposio ao UV) foi estudada, inicialmente, na faixa de concentrao entre

2,5 x 10-7 e 1,5 x 10-5 mol L-1 (n = 3 para cada ponto). Como pode ser observado

na Figura 41, h uma provvel relao linear at a concentrao de 7,5 x10-6 mol

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110

L-1. Em concentraes maiores, h um desvio da linearidade dessa relao (R2 <

0,98). Esse desvio da linearidade pode ter sido causado por efeitos de filtro

interno. Nessas solues mais concentradas, tambm foi observado um maior

desvio padro em cada ponto de medio, expresso no grfico como barras de

erros. A provvel contribuio para o aumento do desvio pdro foi a utilizao de

filtro de transmitncia de 50% para ajustar o sinal medido nas concentraes

maiores a 1,0 x 10-5 mol L-1. Para a medio da fluorescncia das solues com

concentrao maior a 1,0 x10-6, foi utilizado um filtro de transmitncia de 25%,

mas, o fator de erro associado a esse filtro foi menor.

Figura 41 - Relao entre a concentrao de AMT e a fluorescncia aps derivatizao fotoqumica na condio otimizada (HCl 0,027 mol L

-1 e 60 min de exposio ao UV).

Dessa forma, a modo de evitar erros associados ao uso dos filtros de

transmitncia, a faixa linear para o mtodo espectrofluorimtrico para a

determinao indireta de AMT aps (derivatizao fotoqumica) foi validada at a

concentrao de 7,5 x 10-6 mol L-1 (n=3 para cada ponto). Aps a anlise de

regresso, a equao da curva correspondente obtida foi de Y = 2,8 x 108 ( 1,9

x 106 L mol-1) X 3,4 ( 7,8); onde Y a intensidade da fluorescncia, expressa

em unidades arbitrarias (u.a.) e X a concentrao da soluo padro da AMT

(em mol L-1). O coeficiente de determinao (R2) da curva analtica foi de 0,9998

e a anlise do grfico de resduos no mostrou nenhuma tendncia (Figura 42 a

e b). De acordo com a ANOVA realizada, ambos os parmetros apontaram para

um comportamento linear, homocedstico, que relaciona a concentrao da AMT

com a intensidade do sinal fluorescente aps derivatizao fotoqumica. Outra

anlise de regresso mais especfica, cujos resultados se mostram no Anexo D,

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111

tambm apontou para um comportamento homeocedstico dos resduos e por

outro lado indicou que os dados pertencem a uma distribuio normal27. Os

limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ) foram determinados utilizando o

critrio de 3sb/m e 10sb/m, respectivamente, onde sb corresponde ao desvio

padro da intensidade do ensaio do branco (n = 10) e m corresponde

sensibilidade da curva analtica. Os valores calculados para o mtodo

espectrofluorimtrico foram de 4,8 x 10-8 mol L-1 e 1,3 x 10-7 mol L-1,

respectivamente.

Figura 42 - a) Faixa linear do mtodo espectrofluorimtrico para determinao indireta da AMT aps derivatizao fotoqumica (HCl 0,03 mol L

-1 e 60 min UV) e b) respectivo

grfico de resduos

A repetibilidade do mtodo foi estimada mediante o coeficiente de variao

(CV, expresso em %) obtido para as medies da soluo do padro de AMT (n

= 5) preparadas no dia da anlise, em trs concentraes diferentes dentro da

faixa linear do mtodo. A preciso intermediria foi avaliada comparando a

diferena entre as varincias obtidas a partir de medies de solues do padro

da AMT, preparadas em trs concentraes diferentes dentro da faixa linear do

mtodo e em trs dias consecutivos. Os valores do Fcalculado = 3,67; 1,04 e 0,35

para as solues com concentraes de 5,0 x 10-7; 2,5 x 10-6 e 5,0 x 10-6 mol L-1,

respectivamente, indicaram que no houve diferena significativa entre os

resultados dos trs dias de anlise (Fcalculado < Fcrtico 3,88) nas trs concentraes

testadas. Os resultados obtidos para os parmetros de repetibilidade e preciso

27

Pelo teste de Jarque-Bera, descrito no Anexo C, utilizado para testar se uma distribuio normal (Valor crtico < 5,2 a 95% de confiana).

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112

intermediria do mtodo espectrofluorimtrico para determinao indireta da

AMT esto descritos na Tabela 16. Observa-se que na concentrao mais

prxima ao LQ, os coeficientes de variao so maiores, enquanto que nas

outras concentraes ao longo da faixa linear, os mesmos no ultrapassam 4%

do valor da concentrao em teste.

Tabela 16 - Resultados de repetibilidade e preciso intermediria do mtodo espectrofluorimtrico para determinao indireta da AMT aps derivatizao fotoqumica na condio otimizada.

Concentrao (mol L-1

) Repetibilidade (CV, %) Preciso intermediria (%)

5,0 x 10-7

5,6 7,3

2,5 x 10-6

1,5 3,7

5,0 x 10-6

1,1 2,9

A incerteza de medio do mtodo espectrofluorimtrico desenvolvido foi

estimada para as trs concentraes de 5,0 x 10-7; 2,5 x 10-6; e 5,0 x 10-6 mol L-1

de AMT. As principais fontes de incerteza associadas medio da

concentrao do analito foram divididas em quatro grupos: (i) preparao de

solues ; (ii) repetibilidade; (iii) preciso intermediria e (iv) parmetros da curva

analtica. As mesmas foram estimadas utilizando as equaes e os

procedimentos indicados no Captulo 3. Os valores estimados para cada uma

das fontes de incerteza mencionadas e a incerteza de medio associada a cada

concentrao so apresentados na Tabela 17.

Tabela 17 - Valores estimados para cada uma das fontes de incerteza e a incerteza de medio associada ao mtodo espectrofluorimtrico para determinao da AMT aps derivatizao fotoqumica.

Concentrao de AMT (mol L-1

)

5,0 x10-7

2,5 x10-6

5,0 x10-6

Fontes de incerteza Valor da incerteza (mol L-1

)

Preparao de solues (usol) 3,2 x10-9

3,2 x10-8

6,4 x10-8

Curva analtica (ucurva) 4,0 x10-8

4,0 x10-8

4,0 x10-8

Repetibilidade (urp) 1,1 x10-8

1,8 x10-8

2,6 x10-8

Preciso intermediria (upi) 2,0 x10-8

5,2 x10-8

8,5 x10-8

Incerteza combinada (uc) 4,6 x10-8

7,5 x10-8

1,2 x10-7

uc pela concentrao testada, % 9,3 3,0 2,3

Incerteza expandida (Uk = 2,53; 95%) 1,2 x10-7

1,9 x10-7

2,9 x10-7

Na Figura 43 mostrado o grfico de contribuio de cada uma das fontes

de incerteza, em porcentagem, em relao ao valor da incerteza combinada (uc).

Observa-se que a contribuio da incerteza associada curva analtica

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113

apresenta maior influncia sobre o valor da incerteza combinada na menor

concentrao avaliada (5,0 x 10-7 mol L-1), em torno de 8% do valor nominal.

Quanto incerteza associada repetibilidade, no se constata uma influncia

relevante para o valor de uc, para as trs concentraes testadas. A preciso

intermediria contribuiu consideravelmente no valor da incerteza combinada nas

trs concentraes avaliadas, dado que este parmetro pondera as variaes

instrumentais e as variaes no processo de derivatizao fotoqumica em dias

diferentes de anlise.

Figura 43 - Contribuio das fontes de incerteza associadas ao mtodo espectrofluorimtrico para determinao indireta da AMT, nas trs concentraes avaliadas.

5.1.5. Aplicao do mtodo espectrofluorimtrico em medicamento e em material de referncia farmacopico

O mtodo espectrofluorimtrico desenvolvido foi aplicado na determinao

de AMT em um medicamento genrico (Medley, Brasil), contendo 25 mg do

principio ativo por comprimido. Foram preparadas solues do medicamento (n =

3) em trs concentraes correspondentes ao inicio, meio e final da faixa linear,

5,0 x 10-7; 2,5 x 10-6 e 5,0 x 10-6 mol L-1, respectivamente. Os resultados obtidos

com as anlises realizadas com o mtodo proposto neste trabalho foram

comparados com os obtidoso por HPLC (Esrafili et al., 2007) e esto indicados

na Tabela 18. Como pode ser observado o teste t de Student realizado no

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114

indicou diferena significativa entre os resultados obtidos pelos dois mtodos de

anlise.

Tabela 18 - Recuperao em medicamento usando o mtodo espectrofluorimtrico para determinao indireta da AMT aps derivatizao fotoqumica

Concentrao de AMT analisada (mol L-1

)

5,0 x 10-7

2,5 x 10-6

5,0 x 10-6

Mtodo

desenvolvido Mtodo

comparativo Mtodo

comparativo Mtodo

comparativo Mtodo

desenvolvido Mtodo

comparativo

Recuperao (%)

94 0,6 96 1,1 97 7,9 109 0,3 100 3,6 108 1,0

Principio ativo/ comprimido

23,6 0,15 24,1 0,28 24,2 1,97

27,2 0,08 25,1 0,91 27,0 0,24

Teste t 2,39 2,69 3,70 tcrtico ( varincias desiguais; = 2; 95% de confiana, duas caudas) 4,304

Uma amostra de material de referncia farmacopeico (100,0%) adquirida

no Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade (INCQS Fiocruz,

Brasil) foi tambm utilizada neste trabalho para a avaliao do mtodo proposto.

Os resultados obtidos para as anlises de solues preparadas em trs

concentraes diferentes so apresentados na Tabela 19. Pode ser observado

que as recuperaes da AMT no material de referncia foram satisfatrias para

as concentraes testadas, dentro da faixa linear do mtodo desenvolvido.

Tabela 19 - Recuperao em material de referncia farmacopico (INCQS Fiocruz, Brasil), usando o mtodo espectrofluorimtrico para determinao indireta da AMT aps derivatizao fotoqumica.

Concentrao nominal (mol L-1

) Recuperao (%)

5,0 x 10-7

83 3,6

2,5 x 10-6

94 2,8

5,0 x 10-6

93 3,0

Com o intuito de melhorar o poder de deteco para aplicar o mtodo para

determinao de AMT em fludos biolgicos, testes foram realizados visando a

pr-concentrao de AMT mediante uso de extrao em fase slida (SPE). Para

tanto, 100 mL de solues do padro de AMT 5,0 x 10-8 mol L-1 foram

concentradas para 5,0 x 10-7 mol L-1 (volume final de 10 mL), segundo o

procedimento detalhado no Captulo 3. Baseando-se no sucesso dos resultados

obtidos na pr-concentrao de TBZ em saliva (Captulo 4) utilizando metanol

como solvente para a eluio do analito do cartucho de SPE, o mesmo eluente

foi testado para a AMT. Porm, utilizando este solvente como nico meio de

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115

eluio da amostra, a recuperao do analito fortificado no foi satisfatria

(Tabela 20). Esse resultado pode ser explicado devido a que a AMT uma

amina terciria comercializada na forma de cloridrato e, portanto, tm carter

inico. Para a eluio de substncias inicas, procedimentos com eluio

utilizado diferentes propores de NH4OH (1 a 3% em volume) com solventes

orgnicos como metanol ou acetonitrila, tm sido reportados (Lee et al., 1997;

Kushnirr, et al., 1999; Shintani, 1990). Dado que o mtodo desenvolvido para

determinao indireta da AMT aps a derivatizao fotoqumica realizado em

meio cido, a mistura de NH4OH/solvente orgnico no pode ser utilizada para a

eluio do analito. Uma alternativa para esse procedimento seria utilizar um par

inico para eluir a AMT do cartucho. Assim, testes foram realizados utilizando

uma soluo de soluo aquosa 1% de NH4Cl/metanol (1:99 v/v). Aps a eluio

do analito, a derivatizao foi realizada nas condies otimizadas. Dado que a

recuperao do padro do analito utilizando soluo de NH4Cl/metanol 1:99 v/v

foi satisfatria (Tabela 20), a mesma foi testada para eluir AMT aps a

fortificao de soro humano. O analito foi fortificado em plasma humano em

concentraes consideradas txicas (1,0 x 10-6 mol L-1) e eludo em soluo de

soluo aquosa 1% de NH4Cl/metanol (1:99 v/v). Aps a separao da AMT por

SPE, a derivatizao fotoqumica foi realizada nas condies otimizadas e os

resultados obtidos de recuperao da AMT aps a fotoderivatizao e anlise

por espectrofluorimetria foram satisfatrios (104 3 %, n = 3).

Tabela 20 - Recuperaes obtidas em testes de pr-concentrao de solues do padro de AMT 5,0 x 10

-8 mol L

-1 (100 mL) para 5,0 x10

-7 mol L

-1 (10 mL).

Eluente (1 mL) Recuperao (%)

Metanol (100%) 15 5

NH4Cl 1% em metanol (1:99 v/v) 97 2

5.2. Adaptao da abordagem para a cromatografia a lquido

5.2.1. Adaptao da derivatizao fotoqumica da AMT para condies de cromatografia lquida e otimizao da separao cromatogrfica

A derivatizao fotoqumica da AMT, otimizada para o mtodo

espectrofluorimtrico foi adaptada visando o uso do HPLC com deteco por

fluorescncia. A adaptao das condies foi necessria devido s restries do

sistema cromatogrfico em relao ao uso de solues com pH extremo,

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116

evitando a corroso de componentes de ao inoxidvel, que pode ocorrer em pH

< 2, ou para a preservao da fase estacionria da coluna cromatogrfica, cuja

degradao pode ocorrer em pH > 8. A adaptao da derivatizao e a

separao cromatogrfica foram realizadas em trs etapas: (i) adaptando o pH

da reao fotoqumica; (ii) otimizando a separao cromatogrfica e deteco do

analito e (iii) otimizando do tempo de irradiao da amostra.

A faixa de pH tima para uso da coluna cromatogrfica RP-Cyano indicada

pelo fabricante (entre 2 e 7) e o cuidado com as partes metlicas do sistema

cromatogrfico fazem do procedimento de derivatizao fotoqumica

desenvolvido para a espectrofluorimetria incompatvel com seu uso na

cromatografia lquida. Os testes preliminares de fluorescncia da AMT aps

exposio ao UV (Figura 28) indicaram que, na faixa cida, a derivatizao

fotoqumica da AMT obtida mesmo em solues com valores de pH 3 e 5 com

produo de fluorescncia com bandas em dois pares caractersticos de exc/ em,

o de 233/345 nm e o de 263/325 nm. Embora no fosse a condio de induo

de fluorescncia mxima, decidiu-se por optar pelo pH 3 (tampo fosfato 0,01

mol L-1), visando aproveitar a tendncia de aumento de sinal em funo do

aumento da exposio ao UV indicada na superfcie de resposta do

planejamento experimental preliminar (Figura 33). A concentrao do tampo foi

fixada em 0,02 mol L-1 para se evitar o risco de precipitao do sal e

consequente entupimento da coluna cromatogrfica, formao de depsitos nas

tubulaes, conexes e na cabea da bomba do sistema cromatogrfico.

Uma soluo de AMT (1,0 x 10-5 mol L-1), preparada em tampo fosfato

(0,02 mol L-1, pH 3) previamente exposta ao UV (45 min), foi injetada no HPLC

com o intuito de se verificar o comportamento dos fotoderivados da AMT no

sistema cromatogrfico com uma coluna RP-CN (150 x 4,6 mm, com dimetro

de partcula de 5 m). A vazo utilizada nos experimentos (seguindo as

recomendaes do fabricante da coluna) foi de 1,0 mL min-1, com fase mvel de

mesmo pH da soluo de derivatizao da AMT, isto , composta por tampo

fosfato (0,02 mol L-1 pH 3) e metanol e com um volume de injeo de 50 L.

Nos experimentos iniciais foi utilizado o modo de eluio isocrtico com

propores de fase mvel de tampo fosfato (0,02 mol L-1 pH 3)/ metanol

variando de 30/70 para 50/ 50 v/v. O monitoramento de fluorescncia foi

realizado em 233/345 nm, comprimentos de onda mais intensos; obtidos nos

testes preliminares em pH 3 (Figura 44).

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117

Figura 44 - Cromatogramas do fotoderivado (AMT 1 x 10-5

mol L-1

em tampo fosfato 0,02

mol L-1

pH 3; irradiada por 45 min) e do ensaio do branco em propores de fase mvel tampo fosfato (0,02 mol L

-1 pH 3)/metanol (v/v) de: (a) 30/70; (b) 40/60; e (c) 50/50;

monitorados por deteco de fluorescncia em 233/ 345 nm

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118

Como pode ser observado nos cromatogramas da, utilizando essas

condies experimentais, no foi possvel a separao cromatogrfica dos

produtos gerados na derivatizao fotoqumica. Esse resultado indicou a

complexidade de produtos gerados na condio estabelecida. Ao se alterar a

proporo tampo fosfato (0,02 mol L-1 pH 3) e metanol para 60/40 (v/v) no foi

detectado nenhum pico no cromatograma.

Por outro lado, verificou-se que com a utilizao de deteco em 263/325

nm, o cromatograma obtido, utilizando eluio isocrtica com fase mvel na

proporo de tampo fosfato (0,02 mol L-1; pH 3) e metanol igual a 40/60 (v/v),

produziu um pico nico, intenso e bem definido (cromatograma a da Figura 45).

Em contraste, nas mesmas condies, o cromatograma obtido com o

monitoramento em 233/345 nm produziu uma srie de picos mal resolvidos e de

intensidade bem menor que o observado em 263/325 nm (cromatograma b da

Figura 45).

Figura 45 - Cromatogramas do fotoderivado (AMT 1,0 x 10-5

mol L-1;

tampo fosfato 0,02 mol L

-1 pH 3; 45 min UV) em eluio isocrtica e com fase mvel 40/60 v/v (tampo

fosfato 0,02 mol L-1

pH3 /metanol) monitorada em (a) 263/325 nm e (b) 233/345 nm.

Ajustes na proporo de tampo fosfato (0,02 mol L-1 pH 3) e de metanol

na fase mvel foram realizadas visando obter uma maior tempo de reteno e

melhor simetria do pico do fotoderivado detectado em 263/325 nm. Esse ajuste

serviu tambm para se avaliar a pureza do pico, pois caso houvesse um

desdobramento do mesmo ao se mudar a proporo da fase mvel, constatar-

se-ia a presena de mais de um fotoderivado na zona cromatogrfica. Ao utilizar

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119

uma proporo de fase mvel de 30/70 v/v, observa-se que o fotoderivado

eludo prximo ao volume morto do cromatograma (Figura 46). Em uma

proporo de fase mvel maior que 50/50 (v/v), o pico do fotoderivado da AMT

no foi observado. Dessa forma, para a cromatografia da soluo de AMT

submetida fotoderivatizao foi escolhida a fase mvel que consiste em

tampo fosfato (0,02 mol L-1 pH 3)/metanol 40/60 (v/v). Nessa condio, o tempo

de reteno do fotoderivado foi 2,63 min e a simetria de pico foi igual a 1,20.

Figura 46 - Cromatogramas do fotoderivado (AMT 1,0 x 10-5

mol L-1

; tampo fosfato 0,02

mol L-1

pH 3; 45 min UV) monitorado por deteco fluorimtrica (263/325 nm) nas propores de fase mvel de: (a)30:70 e (b) 40:60 v/v (tampo fosfato/ metanol).

Um estudo univariado foi realizado para se avaliar a influncia do tempo de

exposio ao UV na intensidade da fluorescncia (263/325 nm) do pico

cromatogrfico no tempo de reteno de 2,63 min. Para tal, solues de AMT na

concentrao de 1,0 x10-6 mol L-1 foram expostas ao UV em intervalos de 10 min

at 50 min. Paralelamente, a absorvncia dessas solues foi medida no

comprimento de onda caracterstico da AMT (240 nm) para constatar que a AMT

sofre modificaes ao longo do experimento.

A rea de pico do fotoderivado e da AMT para cada injeo apresentada

na Figura 47 na qual se observa que o fotoderivado comea a se formar a partir

de 10 min de exposio ao UV, sendo um patamar mximo de sinal alcanado

aps 30 min. O tempo de exposio ao UV de 30 min foi escolhido para os

estudos de cromatografia visando determinao indireta de AMT a partir de

seu fotoderivado. Pode ser observado que nos testes iniciais para separar o

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120

pico cromatogrfico do fotoderivado da AMT (no cromatograma (c) da Figura 44)

foi utilizado um tempo de irradiao de 45 min, no qual, os fotoderivado

fluorescentes podem ter comeado a se degradar formando um nmero maior de

outras espcies fluorescentes o que pode explicar a diversidade de picos

detectados nesse cromatograma.

Figura 47 - rea de pico do fotoderivado (AMT 1,0 x10-6

mol L-1

; tampo fosfato 0,02 mol L

-1, pH 3) em funo do tempo de exposio ao UV.

Um resumo das condies de fotoderivatizao, de deteco e de

separao escolhidas para a quantificao indireta da AMT apresentado na

Tabela 21. Essas condies foram usadas na etapa de validao e de aplicao

do mtodo cromatogrfico desenvolvido. Os cromatogramas da AMT (1,0 x10-6

mol L-1) e do seu respectivo branco, obtidos nas condies da Tabela 13 so

mostrados na Figura 48.

Tabela 21. - Resumo das condies escolhidas para a determinao cromatogrfica da AMT aps fotoderivatizao.

Descrio Parmetro experimental

Derivatizao fotoqumica Tampo fosfato (0,02 mol L

-1, pH 3) e 30 min de

exposio ao UV

Coluna cromatogrfica RP-CN (cyano), 150 x 4,6 mm; 5 m de dimetro

Fase mvel Tampo fosfato (0,02 mol L-1

pH 3)/metanol 40/60 (v/v)

Temperatura No controlada (ambiente)

Vazo 1 mL min-1

Volume de injeo 50 L

Deteco por fluorescncia 263/325 nm

Tempo de reteno do fotoderivado 2,63 min

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121

Figura 48 - Cromatogramas obtidos para: (a) AMT (1,0 x 10-6

mol L-1

) e (b) ensaio em

branco aps tratamento fotoqumico. AMT preparada em tampo fosfato (0,02 mol L-1

, pH 3) exposta por 30 min ao UV. Fase mvel composta por tampo fosfato (0,02 mol L

-1,

pH 3)/metanol 40/60 v/v. Deteco fluorimtrica em 263/325 nm.

5.2.2. Parmetros analticos de mrito

Para determinar a faixa linear do mtodo, solues de AMT

(concentraes entre 2,5 x 10-8 e 1,0 x 10-5 mol L-1) foram derivadas

fotoquimicamente utilizando as condies escolhidas para a determinao por

HPLC. De acordo com os resultados obtidos28, a faixa linear do mtodo foi

determinada at a concentrao de 2,5 x 10-6 mol L-1, conforme a Figura 49.

Aps uma anlise de regresso, a equao da curva analtica para o mtodo

cromatogrfico proposto foi Y = 6,2 x106 ( 1,3 x105)X + 0,55 ( 0,15); onde Y

a rea do pico do fotoderivado da AMT e X a concentrao equivalente de

AMT, em mol L-1. O coeficiente de determinao, R2, da curva analtica foi de

0,997. A anlise do grfico de resduos mostrou um comportamento

homocedstico para os dados. Outra anlise de regresso mais aprofundada

28

Embora houvesse um comportamento linear utilizando concentraes maiores a 2,5 x10

-6 mol L

-1, visando a aplicao em concentraes de interesse biolgico do

analito, e devido a que nas concentraes altas, a escala do detector de fluorescncia foi quase atingida, a faixa de concentrao validada foi escolhida at 2,5 x10

-6 mol L

-1

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122

(resultados mostrados no Anexo D) apontou que o comportamento dos resduos

no possui alguma tendncia29.

Figura 49 - a) Curva analtica do mtodo cromatogrfico para determinao indireta da AMT aps derivatizao fotoqumica (tampo fosfato 0,02 mol L

-1, pH 3; 30 min UV) e b)

respectivo grfico de resduos.

Os valores de LD e de LQ foram calculados utilizando o critrio de x + 3sb

e x + 10sb, respectivamente, onde x a mdia da menor concentrao

detectvel no equipamento e sb o desvio padro de 10 medies dessa

soluo de menor concentrao. Os resultados apontaram para: LD de 5,4 x 10-9

e LQ de 1,8 x 10-8 mol L-1.

A repetibilidade do mtodo cromatogrfico para determinao indireta da

AMT aps derivatizao fotoqumica foi estimada mediante o coeficiente de

variao (CV, %), obtida para as medies da soluo do padro de AMT (n = 5)

preparadas no dia de anlise, nas mesmas condies, em trs concentraes

diferentes dentro da faixa linear: 2,5 x 10-8; 5,0 x 10-7 e 2,5 x 10-6 mol L-1. A

preciso intermediria foi avaliada comparando as varincias obtidas, a partir de

medies de solues do padro da AMT, preparadas nas mesmas

concentraes e em trs dias consecutivos de anlise, calculando o desvio

padro agrupado dos resultados para os respectivos dias. Os valores obtidos

para Fcalculado foram: 1,31; 2,69; e 2,24 para as solues com concentrao de

2,5 x 10-8; 5,0 x 10-7 e 5,0 x 10-6 mol L-1, respectivamente, indicando que no

houve diferenas significativas entre os dias de anlise (Fcalculado < Fcrtico 3,88;

29

O teste de Jarque-Berra apontou para uma distribuio normal dos dados e apontou para uma leve assimetria da distribuio, conforme os grficos do Anexo C.

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95% de confiana) nas trs concentraes testadas. Os resultados obtidos para

a repetibilidade e a preciso intermediria do mtodo cromatogrfico (Tabela 22)

apontam para um CV entre 9 e 12% na concentrao testada prxima ao LQ (2,5

x 10-8 mol L-1) e valores menores que 6% nas demais concentraes, ao longo

da faixa linear do mtodo desenvolvido.

Tabela 22 - Repetibilidade e preciso intermediria do mtodo para determinao indireta AMT aps derivatizao fotoqumica por HPLC com deteco fluorimtrica.

Concentrao testada (mol L-1

) Repetibilidade (%) Preciso intermediria (%)

2,5 x 10-8

9,3 12,0 5,0 x 10

-7 4,8 5,9

2,5 x 10-6

1,7 6,0

A estimativa da incerteza de medio do mtodo cromatogrfico

desenvolvido foi realizada nas trs concentraes dentro da faixa linear

mencionadas anteriormente. As principais fontes de incerteza associadas

medio foram: (i) a preparao de solues; (ii) a repetibilidade; (iii) a preciso

intermediria e (iv) aos parmetros da curva analtica. As mesmas foram

estimadas utilizando as equaes e os procedimentos indicados no Captulo 3.

Os resultados da estimativa da incerteza de medio para o mtodo

cromatogrfico desenvolvido so apresentados na Tabela 23.

Tabela 23 - Estimativa da incerteza de medio do mtodo cromatogrfico para determinao indireta da AMT, aps derivatizao fotoqumica.

Concentrao testada (mol L-1

)

2,5 x 10-8

5,0 x 10-7

2,5 x10-6

Fonte de incerteza Valor da incerteza (mol L-1

)

Preparao de solues (usol) 5,6 x 10-10

1,1 x 10-8

5,6 x10-8

Curva analtica (ucurva) 6,4 x 10-9

6,9 x 10-8

6,9 x 10-8

Repetibilidade (urp) 2,7 x10-9

1,8 x 10-8

1,9 x 10-8

Preciso intermediria (upi) 3,1 x10-9

5,0 x 10-8

2,3 x 10-8

Incerteza combinada (uc) 7,6 x 10-9

8,8 x 10-8

1,3 x 10-7

uc, % 30% 18% 3,8%

Incerteza expandida (Uk = 2,52; 95%) 1,9 x 10-8

2,2 x 10-8

2,4 x 10-7

Na Figura 50 mostrado o grfico de contribuio de cada uma das fontes

de incerteza anteriormente estimadas para cada concentrao e comparadas

com o valor da concentrao nominal. Observa-se que na concentrao prxima

ao LQ, mesmo estimando o parmetro especificamente para essa faixa de

concentrao, a contribuio associada curva analtica a fonte que mais

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contribuiu ao valor da incerteza combinada. Tambm, dada a variabilidade da

reao fotoqumica, a fonte de incerteza associada preciso intermediria

afetou consideralvemente o valor estimado da incerteza combinada nas

concentraes de 5,0 x10-7 e 2,5 x10-7 mol L-1.

Figura 50 - Contribuio (%) das fontes de incerteza associadas ao mtodo cromatogrfico para determinao indireta da AMT, em trs concentraes avaliadas (2,5 x 10

-8; 5,0 x 10

-7 e 2,5 x 10

-6 mol L

-1).

5.2.3. Aplicao do mtodo cromatogrfico na determinao indireta da AMT

O mtodo cromatogrfico desenvolvido foi aplicado para a anlise de AMT

em: (i) um medicamento genrico; (ii) material de referncia farmacopico; (iii)

em soro humano fortificado. Os procedimentos detalhados para a separao da

AMT nessas matrizes se encontram descritas no Captulo 3.

O medicamento genrico (Medley, Brasil), contendo 25 mg de AMT por

comprimido, foi analisado em trs concentraes diferentes (n = 3) dentro da

faixa linear do mtodo, como mostrado na Tabela 24. Observa-se que, na

concentrao de 2,5 x 10-8 mol L-1 de AMT no foi possvel detectar o

medicamento utilizando um mtodo de referncia (Esrafili et al., 2007). Nas

demais concentraes, os resultados de recuperao para o mtodo

cromatogrfico desenvolvido foram satisfatrios. O teste t aplicado entre os

mtodos proposto e de referncia mostrou que no h diferena significativa

para o nvel de 95% de confiana (tcalculado < tcrtico). Para as anlises do material

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de referncia farmacopico (100,0%, INCQS Fiocruz) foram realizadas

diluies para atingir trs concentraes correspondentes ao incio, meio e fim

da faixa linear do mtodo cromatogrfico desenvolvido. Os resultados de

recuperao obtidos, mostrados na Tabela 25, foram satisfatrios para as trs

concentraes testadas. Provavelmente, dadas s condies mais brandas de

derivatizao fotoqumica da adaptao do mtodo cromatogrfico, os desvios

padro obtidos nos ensaios de recuperao foram maiores que os resultados

obtidos utilizando o mtodo espectrofluorimtrico.

Tabela 24 - Resultados de recuperao da AMT em medicamento utilizando o mtodo cromatogrfico proposto e um mtodo de comparao.

Concentrao de AMT (mol L-1

)

2,5 x10-8

5,0 x10-7

2,5 x10-6

Recuperao (%)

Mtodo cromatogrfico desenvolvido

109 7,3 103 1,3 99 0,4

Mtodo de comparao* --- 105 3,6 102 1,1

teste t (considerando varincias diferentes)

--- 0,54 3,83

tcrtico ( = 2; 95% de confiana) 4,33

* Esrafili, et al 2007

Tabela 25 - Recuperao de AMT em material de referncia farmacopico (100,0%, INCQS Fiocruz) pelo mtodo por HPLC-DF para determinao indireta da AMT.

Concentrao nominal (mol L-1

) Recuperao (%)

2,5 x 10-8

110 9

5,0 x 10-7

111 2

2,5 x 10-6

97 5

Para as anlises de soro humano, foi realizada uma fortificao de soluo

de AMT em uma concentrao considerada txica30 (1,0 x 10-6 mol L-1) na matriz

de interesse. A limpeza da matriz fortificada foi realizada limpando o soro

humano em um cartucho de SPE pr-condicionado com metanol e gua, como

descrito no Captulo 3. Aps vrias lavagens com gua destilada para eliminar a

matriz, o analito foi eludo com a mesma soluo utilizada na pr-concentrao

de solues do padro de AMT (mtodo fluorimtrico), ou seja, mediante a

utilizao de um par inico para eluir a AMT, com a soluo de NH4Cl/metanol

(1:99 v/v). Aps a eluio do analito, a derivatizao fotoqumica e a separao

cromatogrfica foram realizadas nas condies da Tabela 20. Os procedimentos

de SPE, derivatizao fotoqumica e separao cromatogrfica, permitiram a

recuperao do analito com resultados satisfatrios (92 4,5%, n = 3).

30

Optou-se por escolher uma concentrao considerada txica, j que a AMT pode estar presente no organismo na sua forma inica, ou metabolizada para nortriptilina.

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