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7CAPÍTULO 15

TÉCNICAS LABORATORIAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DA Hb S E

SEUS GENÓTIPOS

1. CITOLÓGICAS

1.1. Análise da morfologia eritrocitária – a avaliação da morfologia

eritrocitária deve ser realizada preferencialmente na porção fina do

esfregaço de sangue. O esfregaço pode estar corado com corantes

tradicionais (Giemsa, Wright, etc.) ou a fresco sem coloração (o

esfregaço "italiano"). Em ambas, a análise permite a visualização de

células alteradas nas formas e tamanhos, e do conteúdo hemoglobínico

celular. A avaliação morfológica auxilia na identificação de:

a) talassemia beta (menor, intermédia e maior);

b) talassemia alfa (doença de Hb H);

c) doenças falciformes;

d) hemoglobinas instáveis.

1.2. Teste de falcização – é um teste ainda usado em vários

laboratórios. Sua sensibilidade depende de vários fatores como: tipo de

agente redutor, tempo de reação, temperatura, umidade, vedação,

presença quantitativa de Hb S e Hb Fetal. É uma avaliação apenas

qualitativa que indica, quando positiva, a presença de Hb S nos

eritrócitos, sem caracterizar o genótipo (AS, SS, SC, S + Fetal ou SD).

Princípio:

Sob baixa tensão de oxigênio, os eritrócitos contendo hemoglobina S

tomam a forma característica de foice, ou de meia-lua. O metabissulfito

de sódio reduz a tensão de oxigênio. Assim, quando uma solução de

metabissulfito é adicionada ao sangue total, e esta mistura é vedada

entre lâmina e lamínula por meio de esmalte, os eritrócitos contendo

Hb S se deformam, após algumas horas de repouso.

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Equipamentos:

1. Microscópio.

2. Lâminas de microscopia e lamínulas.

3. Micropipetas de 10µl e 50µl.

4. Placa de Petri.

5. Esmalte para colorir unhas.

Reagentes:

1. Solução de metabissulfito de sódio a 2%:

Na2S2O5 ............................................. 200mg

Água destilada q.s.p. ......................... 10ml

2. Esmalte.

Procedimento:

1. Colocar em um tubo 50µl de sangue total + 100µl de solução

fisiológica 0,9%, misturar por inversão, e adicionar 100µl de

metabissulfito de sódio a 2%. Misturar por inversão;

2. Colocar na lâmina de microscopia 10 a 20µl da mistura e espalhar

por um espaço de 4cm2.

3. Cobrir a preparação com lamínula, e vedar os quatro lados com

esmalte. Conservar a preparação em câmara úmida (placas de Petri

com algodão embebido com água).

4. Examinar em microscópio com objetiva 10 ou 40x, após 1 hora, 3

horas, 6 horas, 12 horas e 24 horas.

Interpretação:

O fenômeno da falcização, ou teste positivo (figura 93, capítulo 9), ocorre

em portadores de Hb S, com variação de tempo entre os diferentes tipos:

Hb SS (1 a 3 horas); Hb SC e Hb SD (3 a 6 horas); Hb S/ talassemia

beta (3 a 12 horas); Hb AS (3 a 24 horas). Entretanto, essa relação

falcização / genótipo / tempo não é constante, e também não serve para

caracterizar o genótipo. Após 24 horas, na ausência de eritrócitos

falcizados, o resultado será dado como negativo.

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Precauções:

1. O metabissulfito deve ser preparado momentos antes de ser

utilizado.

2. A câmara úmida deve ser colocada em lugar fresco, à temperatura

ambiente.

3. A vedação lâmina-lamínula com esmalte é fundamental para o

sucesso da reação.

4. A concentração do metabissulfito, bem como sua preparação no

momento de uso, são pontos críticos.

5. Hb Fetal aumentada, em associação com Hb S, prejudica a

falcização.

1.3. Pesquisa citológica de Hb H e corpos de Heinz – A pesquisa

intra-eritrocitária de Hb H é uma coloração vital efetuada com azul de

cresil brilhante que permite reconhecer a presença de agregados intra-

eritrocitários de Hb H, que estão homogeneamente distribuídos nas

células com aparência de bolas de golfe. A intensidade da presença de

Hb H está relacionada com o grau de lesão do gene alfa, fato que

caracteriza a talassemia alfa (figura 92, capítulo 9).

A pesquisa citológica de corpos de Heinz (figura 60, capítulo 5)

tecnicamente obedece ao mesmo princípio da coloração intra-

eritrocitária de Hb H, com variações no tempo de incubação a 37°C. Os

corpos de Heinz são globinas instáveis que se precipitam no interior dos

eritrócitos. São precipitações grosseiras, em forma de um ou mais

grânulos dispostos heterogeneamente. Os grânulos são pequenos e

esféricos em pessoas com baço, e são grandes e esféricos em

esplenectomizados. É uma técnica determinante no diagnóstico

laboratorial das hemoglobinas instáveis, e auxiliar em situações que

causam metaemoglobinemias, como é o caso da doença falciforme.

Especialmente na anemia falciforme e na Hb S/talassemia beta, a

ocorrência de corpos de Heinz é comum.

Princípio:

Os corpos de inclusões de Hb H (agregados de Hb H) são formados por

cadeias polipeptídicas beta, oriundas da formação do tetrâmero β4. Após

369

coloração vital esses corpúsculos apresentam-se disposto

homogeneamente no interior dos eritrócitos, como pequenos pontos

azulados. Essas inclusões são facilmente diferenciadas dos reticulócitos.

Os corpos de Heinz são partículas de polipeptídeos oriundos da

desnaturação de hemoglobinas, e que se fixam junto à membrana dos

eritrócitos. São encontrados em pacientes com hemoglobinas instáveis,

e após ingestão, inalação, ou absorção dérmica de produtos químicos,

por exemplo: cloratos, fenilhidrazinas e drogas oxidantes. A Hb H e os

corpos de Heinz somente são observáveis após coloração vital (aquosa).

Entretanto, quando submetidas a corantes que usam álcool

(Ramanowsky, Giemsa, Wright, etc.) esses corpúsculos desaparecem

por dissolução.

Equipamentos:

1. Microscópio, com lente de imersão.

2. Tubos de vidro 12 x 75mm.

3. Lâminas.

4. Banho-maria a 37ºC.

5. Micropipeta de 100µl.

Reagentes:

1. Solução azul de cresil brilhante:

Azul de cresil brilhante .................................. 1,0g

Citrato de sódio ............................................. 0,4g

Cloreto de sódio ............................................ 0,8g

Água destilada q.s.p. .................................... 100ml

2. Solução violeta de metila (optativo):

Violeta de metila .......................................... 0,5g

NaCl a 0,9% q.s.p. ....................................... 100ml

Procedimento:

1. Colocar 100µl de sangue em um tubo e adicionar 100µl de azul de

cresil brilhante. Homogeneizar bem por inversão.

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2. Incubar o material contido no tubo a 37ºC, por 30 a 60 minutos.

3. Fazer esfregaços finos, e examinar ao microscópio, com objetiva de

imersão.

Precauções:

1. Utilizar um controle normal.

2. Usar sangue fresco, com anticoagulante (EDTA, ACD e heparina são

recomendados). O excesso de EDTA causa dificuldade na coloração.

3. Checar a temperatura de 37°C do banho-maria.

4. Confirmar o diagnóstico de uma hemoglobina instável, realizando os

seguintes testes adicionais: desnaturação ao calor e ao isopropanol,

eletroforese de hemoglobina, eritrograma, e análise da morfologia

eritrocitária. No caso de doença falciforme identificar o genótipo por

eletroforese.

5. Confirmar a presença de Hb H, geralmente sugestiva de talassemia

alfa, realizando eletroforese de hemoglobina em tampão TEB pH 8,0

– 9,0. O hemolisado deve ser feito preferencialmente com saponina a

1%. Realizar também, o eritrograma e análise da morfologia

eritrocitária.

1.4. Distribuição intra-eritrocitária de Hb Fetal – Esse teste avalia a

distribuição homogênea ou heterogênea da Hb Fetal no interior dos

eritrócitos. A distribuição homogênea se destaca quando todos os

eritrócitos apresentam igualmente a Hb Fetal corada no seu interior,

como são os casos da persistência hereditária de Hb Fetal (PHHF) e da

talassemia beta/delta. A distribuição heterogênea se caracteriza pela

coloração diferenciada nos eritrócitos, onde alguns estão corados pela

presença da Hb Fetal, e outros totalmente descorados pela ausência

(ver figuras 89, 90 e 91do capítulo 9) . Esse mosaico celular é comum

nas talassemias beta com elevação de Hb Fetal, notadamente na

talassemia beta maior. Atualmente, essa técnica tem sido utilizada na

verificação do estímulo que determinadas drogas provocam no gene

gama com síntese de Hb Fetal.

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Princípio:

Esse método é baseado na diferença que existe na capacidade de

dissociação das subunidades entre Hb A e Hb Fetal, em pH abaixo de

4,0. A Hb Fetal é ácido-resistente e por isso não é eluída das células,

corando-se facilmente com eritrosina ou similar, enquanto outros tipos de

hemoglobinas por serem eluídas não fixam o corante.

Equipamentos:

1. Microscópio.

2. pH metro.

3. Vasilha-suporte de lâmina.

4. Lâminas.

5. Banho-maria a 37°C.

Reagentes:

a) Tampão citrato-fosfato pH 3,3:

ácido cítrico 0,1M ....................................... 100ml

fosfato di-sódio hidratado 0,2M .................. 30ml

b) Solução aquosa de eritrosina a 0,1%.

c) Solução de etanol a 80%.

Procedimento:

1. Fazer esfregaços finos, obtidos de sangue sem anticoagulantes, e

fixá-los com etanol a 80%, por cinco minutos. Lavar, a seguir, com

água corrente e secar ao ar.

2. Introduzir os esfregaços em vasilha-suporte de lâminas contendo

tampão citrato-fosfato pH 3,3 previamente aquecido a 37°C, por cinco

minutos. Lavar com água corrente e secar ao ar.

3. Corar com eritrosina por 2 minutos. Lavar com água e examinar em

microscópio com aumento de 400x.

Interpretação:

Os eritrócitos contendo Hb Fetal aparecem corados internamente,

enquanto os outros que não a contém permanecem sem coloração

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interna. A coloração é homogênea quando todos os eritrócitos aparecem

uniformemente corados e, podem ser encontrados em sangue de cordão

umbilical de recém-nascidos, bem como no de portadores de

persistência hereditária de Hb Fetal. A coloração é heterogênea quando

existem duas populações eritrocitárias distintas, ou seja uma corada e

outra sem coloração, e esses são os casos principalmente das diferentes

formas de beta talassemias maior, com exceção dos portadores de

genótipo talassêmico β0 δ / β0 δ.

2. AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE Hb S POR SOLUBILIDADE

Avalia o grau de solubilidade das hemoglobinas. É um teste seletivo

para detectar a presença de Hb S que se caracteriza pela sua insolubilidade quando

induzida ao estado reduzido, fato que não ocorre com as hemoglobinas A, C, D,

Fetal e outras variantes. É um teste que pode ser adaptado para facilitar sua

utilização, como por exemplo: o "teste da mancha", que é uma modificação do

processo de diluição da técnica original pelo uso do tampão fosfato reduzido

embebido num papel de filtro. Quando se goteja o sangue a ser analisado, a forma

de absorção concentrada em torno do ponto central, determina a positividade do

teste.

Esse teste é fundamentado na insolubilidade da Hb S no estado

reduzido. As hemoglobinas normais e as variantes comuns, por exemplo: C, D, N, J,

são solúveis. É um teste que serve apenas para detectar a presença de Hb S.

Equipamento:

1. Tubos de vidro 12 x 75mm.

2. Pipetas de 10ml.

3. Micropipeta de 10 ou 20µl.

Reagentes:

1. Solução fosfato:

KH2PO4 (anidro) ........................................... 33,78g

K2HPO4 (anidro) ........................................... 59,33g

Saponina P.A. .............................................. 2,50g

Água destilada q.s.p. ................................... 250ml

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2. Na2S2O4 (ditionito de sódio)

Procedimento:

1. Dissolver 100mg de ditionito de sódio em 10ml da solução fosfato.

Essa quantidade é suficiente para cinco testes;

2. Em um tubo contendo 2ml da solução acima preparada, adicionar

20µl de sangue total. Misturar por rotação e aguardar 2 minutos;

3. Colocar o tubo a 2cm de um papel branco traçado com linhas pretas

horizontais.

Interpretação:

A turvação da solução (insolubilidade) indica presença de Hb S, fato que

impede a visualização das linhas pretas. As hemoglobinas solúveis

permitem a observação das linhas traçadas no papel.

Precauções:

1. Os sais de fosfato (KH2PO4 e K2HPO4) devem ser anidro;

2. É aconselhável o uso de amostra normal como controle. O controle,

inclusive, pode sofrer ligeira reação floculante, porém as linhas pretas

são sempre visíveis;

3. Para amostras de sangue com hematócrito abaixo de 20% há

necessidade de se usar 50µl de sangue.

3. ELETROFORESES DE HEMOGLOBINAS

3.1. Eletroforese qualitativa em acetato de celulose pH 8 a 9:

Princípio:

Em pH 8,0 – 9,0 a hemoglobina é uma proteína carregada

negativamente, migrando em direção ao pólo positivo. Esse método

identifica as hemoglobinas normais e grande parte das variantes. As

diferentes mobilidades verificadas entre as diversas hemoglobinas com

defeitos estruturais se devem às alterações de cargas elétricas,

causadas por substituições de aminoácidos com diferentes pontos

isoelétricos (pI). As hemoglobinas variantes, oriundas de mutações que

não envolvem alterações de cargas elétricas, geralmente apresentam

374

mobilidade eletroforética semelhante à da Hb A; nesse grupo situa-se a

maioria das hemoglobinas instáveis.

Equipamento:

1. Cuba de eletroforese e fonte geradora de voltagem.

2. Tiras de acetato de celulose.

3. Papel absorvente.

4. Aplicador de amostras.

Reagentes:

1. Solução tampão: Tris-EDTA-borato 0,025M pH 8,5 (TEB pH 8,5).

Tris (hidroximetil) aminometano .............................. 10,2g

Ácido etileno-diamino-tetracético ............................ 0,6g

Ácido bórico ............................................................ 3,2g

Água destilada q.s.p. .............................................. 1 litro

2. Solução corante: Ponceau

Ponceau S .............................................................. 0,5g

Ácido tricloroacético ............................................... 5,0g

Água destilada q.s.p. .............................................. 100ml

3. Solução descorante

Ácido acético glacial .............................................. 100ml

Metanol .................................................................. 50ml

Água destilada ....................................................... 1 litro

Procedimento:

1. Colocar igual quantidade de solução tampão em cada compartimento

eletrolítico da cuba de eletroforese;

2. Embeber o acetato de celulose na solução tampão, previamente

colocada numa vasilha, pelo menos durante 15 minutos;

3. Enxugar o acetato de celulose entre duas folhas de papel absorvente

para remover o excesso de solução tampão;

375

4. Ajustar as tiras de acetato de celulose na cuba de eletroforese,

deixando-as esticadas. Verificar se as suas extremidades estão

mergulhadas na solução tampão de cada compartimento da cuba;

5. Aplicar as amostras nas tiras de acetato de celulose (hemolisado com

saponina a 1%, ou solução de hemoglobina) a 2cm do compartimento

do pólo negativo (cátodo);

6. Passar 200 ou 300 volts por 30 ou 20 minutos, respectivamente;

7. Analisar o fracionamento, inicialmente sem corar;

8. Remover as tiras e corar com Ponceau (ou outro corante de

proteínas) por 10 minutos, no mínimo;

9. Transferir as tiras para a vasilha que contém solução descorante,

agitando-a cuidadosamente por 3 a 5 minutos. Trocar a solução

descorante usada por outra limpa, e deixar as tiras por tempo

necessário para clareá-las;

10. Transparentização do acetato de celulose:

a) mergulhar as tiras descoradas em metanol puro por 1 a 2 minutos;

b) remover as tiras para uma vasilha contendo ácido acético /

metanol / glicerina, na proporção 14:85:1, por 1 minuto;

c) colocar as tiras bem esticadas em superfície de vidro, expondo-as

sob luz infravermelha, a uma distância entre 5 e 10cm, até total

transparentização, ou em estufa a 65°C, por 5 a 10 minutos.

Controle:

Durante a eletroforese é importante o uso de, pelo menos, uma amostra

controle. Na ausência de padrões tipo Hb AS, Hb AC, ou outra forma de

hemoglobina variante, usa-se uma amostra com hemoglobina normal. O

padrão normal constitui-se num excelente meio de comparação entre

hemoglobinas "normais" e "anormais". A utilização de "mapas" de

referência é muito útil na interpretação dos resultados (ver figura 48,

capítulo 4).

Precauções:

Para o sucesso de qualquer eletroforese são fundamentais os seguintes

cuidados:

376

1. Verificar se as mãos, a cuba de eletroforese, as tiras de acetato, o

aplicador e o papel absorvente estão limpos;

2. Observar se a solução tampão não está contaminada por colônias de

fungos;

3. A solução tampão, usada continuamente, é suficiente para quatro ou

cinco procedimentos seguidos. Porém, no uso esporádico, por

exemplo, uma vez por semana, é interessante conservar a cuba, com

tampão, no refrigerador;

4. A obtenção de fracionamento deficiente pode ser causada por:

a) solução tampão deteriorada, ou envelhecida;

b) alteração do pH do tampão;

c) alta molaridade do tampão;

d) corrente elétrica deficiente;

e) má qualidade do acetato de celulose;

f) excesso ou deficiência da amostra aplicada.

2.1. Dosagem de Hb A2 por eletroforese em acetato de celulose

pH 8 – 9:

Utilizam-se os mesmos equipamentos, reagentes, e procedimentos da

técnica anterior.

Procedimento específico:

a) Aplicar 20µl da solução de hemoglobina, por meio de micropipeta,

numa única tira de acetato de celulose, com 4,5 a 5,5cm de largura.

Para acetato de celulose com 2,5cm de largura usar duas tiras,

depositando 10µl em cada uma delas;

b) Passar 200 ou 300 volts para 30 ou 20 minutos respectivamente;

c) Após o fracionamento, as hemoglobinas A e A2, sem prévia

coloração, são recortadas com tesoura e eluídas em tubos contendo

água destilada na quantidade de 3ml (para Hb A2) e 15ml (para Hb

A). Deixar a eluição se processar por 2 horas à temperatura

ambiente, agitando os tubos a cada 15 minutos. Nas eluições

superiores a 2 horas, conservar o material sob refrigeração. Usar

água destilada como branco. Fazer a leitura das DO em 415nm;

377

d) Cálculo:

DO Hb A2

% Hb A2 = x 100

DO Hb A x 5 + DO Hb A2

Valor normal: 2,0 a 4,0.

3.3. Dosagem de Hb S por eletroforese em acetato de celulose

pH 8 – 9:

Os equipamentos, reagentes e procedimentos são idênticos aos do

método anterior.

Procedimento específico:

a) Aplicar 10µl da solução de hemoglobina por meio de micropipeta,

numa única tira de acetato de celulose, com 4,5 a 5,5cm de largura.

Para acetatos de celulose com 2,5cm de largura usar duas tiras,

depositando 5µl em cada uma;

b) Passar 200 ou 300 volts para 30 ou 20 minutos, respectivamente;

c) Após o fracionamento, as hemoglobinas A, S, e A2, sem prévia

coloração, são recortadas com tesoura e eluídas em tubos contendo

água destilada na quantidade de 3ml (para Hb A2), 15ml (para Hb S)

e 15ml (para Hb A). Deixar a eluição se processar por 2 horas à

temperatura ambiente, agitando os tubos a cada 15 minutos. Nas

eluições superiores a 2 horas, conservar o material sob refrigeração.

Usar água destilada como branco. Fazer as leituras das densidades

ópticas (DO) a 415nm;

d) Cálculo:

DO Hb A2

% Hb A2 = X 100

DO Hb A2 + 5 (DO Hb A + DO Hb S)

% Hb A2 x 5 x DO Hb A

% Hb A =

DO Hb A2

% Hb S = 100 – (% Hb A2 + % Hb A)

378

3.4. Eletroforese ácida em gel de agarose pH 6,2:

O emprego da eletroforese em ágar pH 6,2 é específico para diferenciar

alguns tipos de hemoglobinas mais lentas do que a Hb A, quais sejam:

Hb S da Hb D e Hb C da Hb E, que migram em posições similares em

eletroforeses alcalinas. Por essa técnica as hemoglobinas S e C

separam-se da Hb A, enquanto as hemoglobinas D e E migram na

mesma posição da hemoglobina A. Esse sistema de fracionamento

propicia, também, a identificação semi-quantitativa de Hb Fetal (ver

figuras 48 do capítulo 4, e 100 do capítulo 9).

Equipamento:

1. Cuba de eletroforese e fonte geradora de voltagem.

2. Papel de filtro.

3. Aplicador de amostra (lamínula ou lâmina de barbear).

4. Erlenmayer de 200 a 250ml.

5. Lâmina de microscópio.

6. Pipetas de 10ml.

Reagentes:

1. Solução tampão fosfato pH 6,2

Na2HPO4 ...................................................... 2,02g

NaH2PO4 . H2O ............................................ 7,66g

Água destilada q.s.p. ................................... 1 litro

Esta solução será usada nos compartimentos eletrolíticos bem como

na preparação do gel de ágar.

2. Bacto-Ágar (Difco Lab.)

Procedimento:

1. Colocar no erlenmayer 200mg de ágar e dissolvê-lo em 20ml do

tampão fosfato, levando-o ao fogo e agitando-o rotatoriamente a cada

10 minutos, até completa dissolução do ágar;

2. Pipetar 3,5ml do gel liqüefeito em cada lâmina. Esse procedimento

deve ser realizado cuidadosamente: coloca-se a pipeta verticalmente

na porção média da lâmina, e deixa-se que o gel se escoe

379

lentamente por toda a extensão da lâmina, até completar o volume de

3,5ml, deixar por 10 a 15 minutos em repouso;

3. Aplicar as amostras (solução de hemoglobina, ou hemolisado com

saponina) na porção média da lâmina. Para isso usa-se o pedaço de

lamínula, ou de lâmina de barbear (tipo Gillette), molhado em sua

extremidade com a amostra a ser analisada. A aplicação se faz

introduzindo verticalmente o aplicador no gel, observando-se o

cuidado de não atingir a lâmina;

4. Colocar a lâmina na cuba de eletroforese, e conectar suas

extremidades com os respectivos compartimentos eletrolíticos por

meio de "pontes" realizadas com duplo papel de filtro;

5. Passar 100 a 150 volts por 20 a 15 minutos, respectivamente;

6. Analisar o fracionamento, inicialmente sem corar;

7. Remover a lâmina e corar com Ponceau S (ou outro corante de

proteínas) por 20 minutos;

8. Descorar com ácido acético a 5%.

Observação: Atualmente há a disposição kits prontos para este tipo de

eletroforese em gel de agarose ácida.

3.5. Eletroforese por focalização isoelétrica:

Na eletroforese de focalização isoelétrica (EFI) as proteínas são

fracionadas de acordo com o seu pI ao longo de um gradiente de pH (ver

figura 88 do capítulo 9). Este processo é estabelecido por um amplo

conjunto de anfólitos isoeletricamente, ou por uma matriz carregada e

obtida pela copolimerização de variável quantidade de derivados acrilol,

básicos e ácidos, dentro do gel de poliacrilamida ou gel de agarose. Por

esse processo é possível identificar cerca de 80 hemoglobinas variantes

humanas.

A eletroforese de focalização isoelétrica apresenta algumas vantagens

específicas sobre os outros procedimentos eletroforéticos e

cromatográficos. As vantagens sobre outros procedimentos

eletroforéticos podem ser resumidas em dois itens:

380

1. em grande parte, os resultados de EFI não dependem da forma de

aplicação, do total de proteína aplicada e do tempo de manipulação.

Podem ser medidos parâmetros fisioquímicos intrínsecos de

proteínas variantes, ou seja, pelos seus diferentes pI;

2. é possível obter resoluções excelentes entre variantes cujos pI

diferem 0,02 por unidade pH se analisado por anfólitos carregados

isoeletricamente, ou por diferença de 0,001 por unidade de pH se

analisado por matriz obtida de copolimerização de derivados acrilóis.

Por outro lado, as vantagens sobre processos cromatográficos são as

seguintes:

1. quantidade de amostra requerida para análise (10-50µg) muito

pequena em comparação com a utilizada nas cromatografias por

troca iônica ou líquida de alta pressão (200-300µg);

2. várias amostras podem ser analisadas de uma só vez, com

resultados obtidos rapidamente.

As aplicações EFI no estudo das hemoglobinopatias são as seguintes:

"Screening" de hemoglobinopatias em recém-nascidos – a

eletroforese de focalização isoelétrica permite a separação dos três

principais componentes de hemoglobinas do sangue de cordão umbilical;

Hb Fetal (concentração média no recém-nascido normal de 70%), Hb A

(valores normais variáveis de 11 a 13%) e Hb Fac – derivado acetilado

da Hb Fetal (valor médio de 10%), todas separadas na ordem

decrescente de seus respectivos pIs. Esta técnica não dá resultados

falso-negativos. Entretanto, falso-positivos podem ser encontrados nos

recém-nascidos prematuros, da mesma forma que no sétimo mês de

gestação o nível de Hb A está abaixo de 10%. A vantagem deste método

em recém-nascidos é a possibilidade de se focalizar diretamente o

tetrâmero intacto da hemoglobina. Além disso, permite a sensível

detecção de Hb S, Hb C, talassemias beta maior (Hb Fetal próxima de

100%), presença de Hb Bart's e várias outras hemoglobinas anormais.

381

3.6. Cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) – É uma das mais

sensíveis formas de fracionamento cromatográfico. As colunas com

diferentes gradientes de pH e composição química são previamente

adquiridas, conforme o teste que se deseja realizar. Para o estudo de

hemoglobinas, especialmente o estrutural, a resolução do fracionamento

de péptidos previamente rompidos dos polipeptídeos é altamente

sensível. Da mesma forma, a avaliação quantitativa de aminoácidos de

cada péptido. A HPLC atualmente substitui os tradicionais métodos de

cromatografia por troca iônica, bem como o mapeamento peptídico pela

técnica de "fingerprinting", e atualmente é muito usada no diagnóstico de

Hb S em sangue de recém-nascido.

4. DOSAGENS DE HEMOGLOBINA

4.1. Dosagem de Hb Fetal:

Princípio:

A Hb Fetal é mais resistente à desnaturação por soluções fortemente

alcalinas do que outros tipos de hemoglobinas. O teste é realizado

adicionando uma determinada quantidade de solução alcalina em uma

concentração conhecida de hemolisado. Após um tempo específico, a

desnaturação é bloqueada por adição de sulfato de amônio saturado, ou

parcialmente saturado. O sulfato de amônio diminui o pH e precipita a

hemoglobina desnaturada. Após a filtração, a quantidade de

hemoglobina inalterada é avaliada e expressa como hemoglobina álcali-

resistente (ou Hb Fetal) em valores percentuais. Apresentaremos a

técnica de quantificação de Hb Fetal:

Método de Betke

Equipamentos:

1. Espectrofotômetro.

2. Pipetas de 1ml, 2ml, 5ml e 10ml.

3. Cronômetro.

4. Papel de filtro (Whatman nº 1, S & S, Toyo).

5. Tubos 17 x 100mm.

382

6. Funis pequenos – 3 a 4cm de diâmetro.

Reagentes:

1. Solução de Drabkin (cianeto)

K3Fe(Cn)6 ........................................... ......... 200mg

KCN ............................................................. 200mg

Água destilada q.s.p. ................................... 1 litro

2. NaOH 1,2 N:

NaOH ........................................................... 48g

Água destilada q.s.p. ................................... 1 litro

3. Solução saturada de sulfato de amônio

(NH4)2 SO4 ................................................... 500g

Água destilada q.s.p. ................................... 500ml

Procedimento:

1. Diluir 0,6ml da solução de hemoglobina em um tubo contendo 10ml

da solução de Drabkin. Homogeneizar por inversão;

2. Colocar 5,6ml da solução de hemoglobina diluída no item 1 em um

tubo rotulado "Hb Fetal". Adicionar 0,4ml da solução de NaOH 1,2 N

e acionar o cronômetro. Agitar cuidadosamente por 10 segundos;

3. Ao final de 2 minutos exatos, adicionar 4ml da solução saturada de

sulfato de amônio. Homogeneizar por inversão e deixar em repouso

por 5 a 10 minutos, no máximo;

4. Filtrar o conteúdo do tubo "Hb Fetal" em duplo papel de filtro;

5. Preparar a solução padrão, colocando em um tubo de ensaio: 1,4ml

da solução de hemoglobina diluída no item 1; 0,1ml de água destilada

e 1ml da solução saturada de sulfato de amônio. Homogeneizar e

transferir 1ml dessa solução para outro tubo, e juntar 9ml de solução

de Drabkin. A solução padrão é 10 vezes mais diluída do que a

solução de hemoglobina álcali-resistente ou "Hb Fetal";

6. Ler a densidade óptica (DO) do tubo "Hb Fetal" e do padrão em 540

ou 415nm, contra um branco de solução de Drabkin.

383

Cálculo:

DO Hb Fetal

% Hb Fetal = x 100

DO padrão x 10

Interpretação:

Adultos normais: 0,0 a 2,0% de Hb Fetal.

Essa técnica é recomendada quando os níveis de Hb Fetal estão abaixo

de 40%.

4.2. Dosagem de Metaemoglobina:

Princípio:

A metaemoglobina é um subproduto resultante da transformação da

oxiemoglobina. Essa transformação é decorrente da contínua oxidação

da hemoglobina que ocorre notadamente devido ao envelhecimento e

conseqüente apoptose (morte natural) do eritrócito. Entretanto outros

fatores podem influenciar no aumento da concentração de

metaemoglobina, por exemplo: Hb S (AS, SS, SC, SF), talassemia beta

maior e menor, Hb instáveis, oxidações induzidas pela deficiência de

G-6PD, e oxidações "adquiridas" de medicamentos (ex.: sulfas, nitros,

etc.), alimentos, meio ambiente poluído (ex.: gases de NOx e SOx).

Reagentes:

1. Solução estoque de tampão fosfato M/15

Na2HPO412H2O .......................................... 9,0g

KH2PO4 ....................................................... 5,7g

Água destilada q.s.p. .................................. 1 litro

2. Solução trabalho de tampão fosfato M/60

Diluir 250ml da solução estoque para 1 litro de água destilada q.s.p.

Obs.: conservar as soluções estoque e trabalho em refrigerador.

3. Saponina a 1%

Procedimento:

Para cada análise usar dois tubos de hemólise identificados por A e B.

384

Tubo A: Colocar primeiramente 100µl de sangue total, coletado com

anticoagulante e adicionar 100µl de saponina. Agitar o tubo para induzir

a hemólise. A seguir, adicionar 6ml do tampão fosfato M/60.

Homogeneizar por inversão.

Tubo B: Colocar 300µl da mistura do tubo A e, a seguir, 3ml do tampão

fosfato M/60. Homogeneizar por inversão.

Leituras espectrofotométricas:

a) Ajustar o espectrofotômetro em comprimento de onda 630nm, usar

o tampão fosfato M/60 como branco e acerto do zero da absorbância,

e a seguir fazer a leitura do tubo A, anotando o valor da densidade

óptica (DO).

b) Ajustar o espectrofotômetro em comprimento de onda 540nm, usar

o tampão fosfato M/60 como branco e acerto do zero da absorbância,

e a seguir fazer a leitura do tubo B, anotando o valor da densidade

óptica (DO).

Cálculo:

DO 630nm x 100

% de Meta Hb =

DO 630nm + (DO 540nm x 10)

Interpretação:

A leitura do tubo A em 630nm avalia a absorbância da metaemoglobina

obtida da hemólise dos eritrócitos e diluída em solução tamponada. Por

outro lado, a leitura do tubo B, sob as mesmas condições, em 540nm

avalia a absorbância da oxiemoglobina. Para obter sensibilidade técnica

na leitura, a solução do tubo B foi diluída dez vezes.

Valores normais:

Os valores normais para concentração de metaemoglobina variam de 0

a 4%.Valores acima de 4% são considerados elevados.

385

5. ANÁLISES POR BIOLOGIA MOLECULAR DA Hb S

Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, o conhecimento

das alterações genéticas obteve um excepcional desenvolvimento. Esse fato

permitiu, também, que se conhecessem os diferentes pontos de mutações das

hemoglobinopatias variantes, em especial da Hb S, e das talassemias.

A organização, estrutura e função dos genes que sintetizam as

globinas, assim como sua localização nos respectivos cromossomos estão bem

conhecidas, e esse fato tem facilitado o estudo em nível molecular das alterações

das hemoglobinas.

A primeira etapa do estudo molecular é a obtenção do DNA na sua

forma mais pura possível, cuja técnica segue alguns protocolos entre os quais o

exposto na tabela 48. Para o estudo do DNA usam-se as enzimas (endonucleases

de restrição) produzidas por determinadas bactérias e que têm a capacidade de

"cortar" o DNA em pedaços com seqüências de bases nitrogenadas específicas.

Para fins práticos, a presença ou ausência de um ponto de reconhecimento (sítio) de

uma endonuclease de restrição é devida à sua susceptibilidade a uma determinada

enzima de interesse para o estudo molecular. Duas técnicas podem ser utilizadas

com esta finalidade, o PCR ("polimerase chain reaction") e o "Southern blotting".

O PCR é mais viável tecnicamente no momento, e consiste na

repetição cíclica da síntese de DNA, mediada por ação enzimática por meio de

iniciadores ("primers") com cerca de 20 nucleotídeos de orientação oposta, com

seqüências complementares às duas extremidades do fragmento que se pretende

copiar. Destaca-se que os "primers" são específicos para cada segmento de DNA

que se pretende estudar. O processo de amplificação pela técnica do PCR se realiza

em três etapas distintas:

1. separação das fitas de DNA que se quer amplificar, a uma

temperatura de 94ºC;

2. ligação complementar entre os iniciadores e o DNA, a uma

temperatura entre 40 e 60ºC, com formação de pequenos

fragmentos de fita ;

3. a síntese do DNA pela taq-polimerase (enzima obtida de bactéria

resistente a altas temperaturas), a 72ºC que irá inserir os

nucleotídeos complementares, originando duas fitas duplas do DNA

idênticas à original.

386

Tabela 48 – Método para extração rápida de DNA com uso de CTAB e DTAB

Introdução

Este procedimento permite a obtenção rápida de amostras de DNA genômico a partir de pequena

quantidade de sangue.

Soluções

DTAB 12% (dodecyl-trimetil-amonium-bromide)

Clorofórmio

CTAB 8% (cetyl-trimetil-amonium-bromide)

NaCl 1,2 M

Etanol absoluto

Etanol a 70%

H2O deionizada

Etapas

1. preparar "buffy coat" de um volume de 5ml de sangue colhido com anticoagulante, centrifugando

10min a 1.500rpm;

2. recolher o "buffy coat" e dividi-lo em dois tubos tipo "Eppendorf" de 2ml; 500µl para cada tubo;

3. adicionar 500µl de DTAB (dodecyl trimethylammonium bromide – Sigma D08638) a 12% e

homogeneizar por inversão por 15s;

4. incubar em banho-maria a 68ºC por 5min;

5. adicionar 900µl de clorofórmio e homogeneizar imediatamente por inversão vigorosa por 15s;

6. centrifugar a 10.000rpm em centrífuga refrigerada por 2 minutos; formar-se-ão três camadas;

7. transferir o sobrenadante para outro tubo tipo "Eppendorf" contendo 100µl de CTAB (cetyl

trimethylammonium bromide – Sigma H-5882) a 5% e 900µl de água;

8. homogeneizar por inversão até a formação do precipitado;

9. centrifugar a 10.000rpm em centrífuga refrigerada por 2min e desprezar o sobrenadante;

10. dissolver o precipitado em 300µl de NaCl 1,2M;

11. adicionar 750µl de etanol a 99,5% à temperatura ambiente;

12. homogeneizar para precipitação o DNA e centrifugar a 10,000rpm em centrífuga refrigerada por

2min;

13. Desprezar o sobrenadante;

14. Lavar uma vez com etanol a 70% e centrifugar a 10.000rpm por 2min;

15. Descartar o etanol e secar as paredes do tubo

16. Dissolver o DNA em 300µl de água, usando vórtex por 20s;

17. Determinar a concentração do DNA em espectrofotômetro (260 / 280nm.

387

A orientação oposta dos iniciadores faz com que a síntese de DNA

ocorra na região interna entre eles. Assim, o produto da extensão de um iniciador é

utilizado como substrato para outro iniciador no ciclo seguinte, resultando na

duplicação de quantidade de moléculas de DNA sintetizadas no ciclo precedente,

sendo que cada ciclo apresenta duração de aproximadamente 10 minutos. Após

algumas horas, cerca de 30 ciclos são realizados com a possibilidade de se

conseguir perto de um bilhão de cópias disponíveis do fragmento de DNA

inicialmente trabalhado. As etapas da amplificação por PCR devem seguir as

especificações do fabricante do equipamento termocíclico, pois serão necessários

para cada estudo determinados componentes como taq-polimerase,

oligonucleotídeos e "primers" específicos. Após a amplificação do pequeno

segmento de DNA que contém o sítio de interesse, submete-o à digestão com a(s)

enzima(s) apropriada(s). Se houver digestão, serão gerados dois fragmentos

menores do que o inicial, indicando que o sítio é suscetível à ação da enzima

(representada por sinal +). Se não houver digestão, o tamanho do fragmento não se

altera (representado por sinal – ). Quando há numerosos sítios polimórficos, ao

longo de um complexo gênico, cada uma das diferentes combinações desses sítios

no mesmo cromossomo é denominada de haplótipo (ver figura 65 do capítulo 6). O

número potencial de haplótipo é muito grande. No entanto, muitos não foram até

hoje observados e, dessa forma, um pequeno número predomina nas populações

humanas.

A técnica de "Southern blotting", por sua vez, consiste em digerir o

DNA com uma enzima de restrição e submeter o DNA fragmentado a uma

eletroforese em gel de agarose, que as separa em função de seus pesos

moleculares. Após o fracionamento, o DNA é desnaturado para se obter uma

simples hélice, e os fragmentos desnaturados são transferidos para um filtro de

nitrocelulose, cujo procedimento é denominado por "blotting". Após a transferência, o

DNA é hibridizado com sondas específicas (pedaços de DNA complementares ao

gene que se deseja estudar e marcados radioativamente) formando um complexo

radioativo. O excesso de sondas é lavado, e o filtro de nitrocelulose é colocado em

contato com um filme que irá revelar os locais ou os segmentos de DNA que foram

complementares às sondas, e finalmente analisados por meio de auto-radiografia. O

padrão de restrição obtido ao final do processo indicará a presença de bandas

388

anormais e ausência de bandas normais, evidenciando os eventuais defeitos

moleculares presentes no DNA.