18º Congresso de Iniciação Científica FLOCULAÇÃO DE ... ?· 18º congresso de iniciação científica…

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  • 18 Congresso de Iniciao Cientfica

    FLOCULAO DE LEVEDURAS: ESTUDO DO COMPORTAMENTO DA LEVEDURASACCHAROMYCES CEREVISIAE EM PROCESSO DE FERMENTAO ALCOLICA

    Autor(es)

    NATLIA DE MORAES FURTADO

    Orientador(es)

    VALMIR EDUARDO ALCARDE

    Apoio Financeiro

    FAPIC/UNIMEP

    1. Introduo

    A floculao um fenmeno apresentado por leveduras, as quais se unem em agregados denominados flocos constitudos por vriasclulas. A ocorrncia da floculao na fermentao alcolica pode ser causada pela presena de linhagens floculentas do gneroSaccharomyces e por bactrias contaminantes. Nas usinas de lcool a contaminao bacteriana considerada a principal responsvelpela floculao do fermento (ALCARDE, 2001; ALCARDE & PASCHOALINI, 2008)A contaminao bacteriana um dos fatores preponderantes dentre aqueles que afetam a fermentao alcolica, posto que o maisfrequente agente estressante presente. Segundo Amorim (2005), o maior efeito das bactrias na levedura e no rendimento dafermentao fsico. As bactrias se unem com as leveduras provocando floculao, que vo ao fundo da dorna ocasionando nacentrifugao entupimento de bicos, canalizaes ocorrendo muita perda de levedura, resultando uma queda no rendimento. Estefenmeno, bastante comum nas destilarias tem motivado a indstria de lcool e pesquisadores na busca de alternativas para estaquesto.O mecanismo atravs dos quais as bactrias exercem efeito direto na floculao de leveduras no est totalmente esclarecido. Nafloculao de leveduras floculentas o modelo mais aceito o "modelo das lectinas", proposto por Miki et al. (1982). Este modeloprope a ocorrncia de uma ligao especfica entre as protenas (lectinas) de clulas floculentas e os receptores de manana da paredecelular de clulas adjacentes, requerendo ainda a presena de ons clcio, cuja funo a de manter as lectinas em sua conformaoativa.No entanto, a diversidade dos microrganismos e dos agentes envolvidos na floculao do fermento nas dornas de fermentao, bemcomo o grande volume de mosto manuseado durante a fermentao alcolica industrial, tornam o controle do processo um desafio degrande importncia e dificuldade. A elucidao das diferentes causas envolvidas neste processo permitir um controle eficiente eeconmico do fenmeno da floculao.

    2. Objetivos

  • Verificar as condies de ocorrncia da floculao da levedura Saccharomyces cerevisiae causada por espcies de Lactobacilluscontaminantes do processo de produo de lcool; Avaliar o efeito combinado do pH, concentrao de ons e teor alcolico no processo de floculao; Investigar o mecanismo de floculao entre leveduras e bactrias.

    3. Desenvolvimento

    3.1. Culturas de levedurasPara este estudo foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae (FT 134 L). Para reativao das clulas de levedura foi utilizado omeio de cultivo lquido YEPD (extrato de levedura-1,0%; peptona-1,0%; dextrose-2,0).

    3.2. Culturas de bactriasAs culturas de bactrias utilizadas nos experimentos foram: Lactobacillus fermentum (FT282B), L. plantarum (FT025B) e L. buchneri(FT414B). Para a reativao e crescimento das culturas de Lactobacillus foi utilizado o meio de cultivo "De Man, Rogosa, Sharp -MRS Difco 0881-01-3.

    3.3. Condies de cultivo de clulas para o teste de floculaoAs leveduras foram cultivadas em caldo YEPD por 24-48 horas a 30oC, utilizando como inculo 1% de um cultivo de 24 horas emcaldo. As bactrias foram cultivadas em caldo MRS por 24-48 horas a 30oC, utilizando como inculo 1% de um cultivo de 24 horasem caldo. Aps o crescimento, as clulas foram centrifugadas a 3600 G por 10 minutos a 4oC e lavadas duas vezes com soluo deetilenodiaminotetractico dissdico dihidratado (Na2EDTA) 0,025M, sendo posteriormente ressuspendida em gua deionizada, emtampo Tris-HCl 10-1M, pH 7,0-7,5 .

    3.4. Relao entre as concentraes celulares na floculaoPara os testes de floculao foi utilizada cultura de levedura com concentrao de 10% v/v, com uma populao entre 1 a 5,0 x 108clulas de levedura/mL.Os testes de floculao foram conduzidos com populao superior a 1,0 x 108 clulas de bactria/mL.

    3.5. Teste de floculaoOs testes de floculao foram realizados de acordo com o mtodo de Stratford & Keenan (1988), adaptado para a utilizao desuspenses mistas de leveduras e bactrias. Este mtodo baseia-se na velocidade de sedimentao e clarificao do sobrenadante dasuspenso de microrganismos. Desta forma adicionou-se a tubos de ensaio (16 x 150 mm) 3 mL da suspenso de leveduras, 3 mL dasuspenso de bactrias e soluo de CaCl2 5x10-2M em quantidade suficiente para se obter uma concentrao final de 1x10-2M. Aseguir os tubos foram agitados manualmente por 2 minutos, mantido em repouso por 5 minutos e depois, com auxilio de um pipetadorautomtico, coletou-se 3 mL da amostra do sobrenadante, medindo-se sua absorbncia em espectrofotmetro a 600nm.

    3.6. Efeito do pH x concentrao de ons x teor alcolico na floculao

    Para se verificar o efeito combinado do pH, presena de ons e teor alcolico no processo de floculao, foram realizados testes defloculao na condio de tampo Tris HCl 10-1M, pH 7,0-7,5, e testes de floculao na condio de pH 4,5 e pH 3,0 na presenade Ca++ - 400 ppm, Mg++ - 200 ppm e K+ - 1500 ppm, e na presena de 10% de lcool (efeito combinado pH x ons x teoralcolico), uma vez que estas variveis podem ocorrer em conjunto em processos industriais de fermentao alcolica.

    4. Resultado e Discusso

    A floculao da levedura Saccharomyces cerevisiae (FT134L) ocasionada pela presena das bactrias Lactobacillus plantarum(FT025B), Lactobacillus fermentum (FT282B) e Lactobacillus buchneri (FT414B) pde ser avaliada pela rpida diminuio daturbidez da suspenso das clulas da levedura, com o decorrer do tempo. Na ausncia da floculao, a turbidez da suspenso diminuivagarosamente, mas na presena de bactrias floculantes a reduo da turbidez acelerada.Os resultados dos testes de floculao realizados entre a levedura Saccharomyces cerevisiae (FT134L), e Lactobacillus plantarum(FT025B), Lactobacillus fermentum (FT282B), Lactobacillus buchneri (FT414B) encontram-se na Tabela 2. Para interpretao dosresultados utilizou-se a padronizao de acordo com Santos (1991), considerando fortemente floculante (+++) as espcies bacterianas

  • que proporcionaram uma leitura da absorbncia inferior a 0,25, mediamente floculante (++) as leituras entre 0,25 a 0,40, fracamentefloculante (+) as bactrias que proporcionaram leitura entre 0,40 a 0,65 e como no floculante (-) as leituras (absorbncia) superiores a0,65.

    4.1Avaliao da capacidade floculante de bactrias frente levedura Saccharomyces cerevisiae (FT134L)

    Os resultados dos testes de floculao realizados com a levedura Saccharomyces cerevisiae (FT134L) e as bactrias contaminantesencontram-se na Tabela 1.Os resultados obtidos indicam que Lactobacillus fermentum (FT282B), L. plantarum (FT025B) e L. buchneri (FT414B) suspensas emtampo Tris HCl 10-1M, pH 7,0-7,5 apresentaram capacidade de provocar a floculao da levedura Saccharomyces cerevisiae(FT134L).Para os testes de floculao foi utilizada cultura de levedura com concentrao entre 1 a 5,0 x 108 clulas de levedura/mL e culturasde bactrias com concentrao superior a 1,0 x 108 clulas de bactria/mL, concentraes estas comumente encontradas em dorna defermentao alcolica.Os resultados obtidos nessa pesquisa confirmam que as bactrias, Lactobacillus fermentum (FT282B), L. plantarum (FT025B) e L.buchneri (FT414B) so hbeis em provocar floculao de clulas da levedura Saccharomyces cerevisiae (FT134L), como j haviasido citado por outros autores (ALCARDE; YOKOYA, 2003 e ALCARDE & PASCHOALINI, 2008).

    4.2 Avaliao da capacidade floculante de bactrias frente levedura FT134L, na presena de ons, teor alcolico 10%, pH 3,0 e pH4,5

    A capacidade floculante de bactrias frente levedura FT134L, na presena de ons, teor alcolico 10%, pH 3,0 e pH 4,5 estodispostos na Tabela 2.Na presena de Ca++400ppm + Mg++200ppm + K+1500ppm + 10% de lcool e pH 3,0, L. fermentum (FT282B), L. plantarum(FT025B) e L. buchneri (FT414B), no apresentaram capacidade de provocar a floculao da levedura Saccharomyces cerevisiae(FT134L).Na presena de Ca++400ppm + Mg++200ppm + K+1500ppm + 10% de lcool e pH 4,5, L. fermentum (FT282B), L. plantarum(FT025B) e L. buchneri (FT414B), no apresentaram capacidade de provocar a floculao da levedura Saccharomyces cerevisiae(FT134L).Atravs desses resultados pode-se perceber que a presena de lcool na dorna de fermentao pode influenciar a capacidade floculanteda levedura Saccharomyces cerevisiae (FT134L) frente s bactrias contaminantes. Alcarde (2001) observou que a presena de etanolno meio apresentou efeito inibitrio no processo de floculao entre a levedura Saccharomyces cerevisiae (FT134L) e as espciesbacterianas Lactobacillus fermentum (FT0282B); Lactobacillus plantarum (FT025B); e Lactobacillus buchneri (FT414B) uma vezque as leituras de absorbncia encontradas para as cepas bacterianas que haviam apresentado habilidade em flocular esta leveduraforam superiores as leituras de absorbncia quando no havia a presena de etanol no meio de floculao. Portanto, para os mesmosnveis bacterianos estudados, as leituras de absorbncia encontradas nos testes de floculao foram crescentes na ausncia de lcoolno meio, com 10% de teor alcolico respectivamente.

    5. Consideraes Finais

    De acordo com os resultados obtidos nos experimentos realizados conclui-se que Lactobacillus plantarum (FT025B), Lactobacillusbuchneri (FT414B) e Lactobacillus fermentum (FT282B) podem provocar a floculao da levedura Saccharomyces cerevisiae(FT134L) em tampo Tris HCl 10-1M, pH 7,0-7,5O teor alcolico de 10% em meio com presena de Ca++400ppm + Mg++200ppm + K+1500ppm + 10% de lcool e pH 3,0 e 4,5, L.fermentum (FT282B), L. plantarum (FT025B) e L. buchneri (FT414B), no apresentaram capacidade de provocar a floculao dalevedura Saccharomyces cerevisiae (FT134L).

    Referncias Bibliogrficas

    ALCARDE, V.E. Avaliao de parmetros que afetam a floculao de leveduras e bactrias isoladas de processos industriais defermentao alcolica. Campinas: 2001. 91p. Dissertao (Doutorado) Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP.

    ALCARDE, V.E. & YOKOYA, F. Efeito da populao de bactrias na floculao de leveduras isoladas de processos industriais de

  • fermentao alcolica. STAB Acar, lcool e Subprodutos. Piracicaba: mar/abr, 2003.

    ALCARDE, V.E.; LACERDA, T.H.M.; OLIVEIRA, F.C. Efeito de parmetros que afetam o processo de floculao da leveduraSaccharomyces cerevisiae. Anais da I Mostra Acadmica da UNIMEP. Piracicaba: UNIMEP, 2003.

    ALCARDE, V.E. & PASCHOALINI, G. Influncia do teor alcolico e de ons clcio no processo de floculao entre leveduras ebactrias. Anais da VI Mostra Acadmica da UNIMEP. Piracicaba: UNIMEP, 2008.

    AMORIM, H.V. de. Fermentao alcolica: Cincia e tecnologia. Piracicaba: Fermentec, 2005. 103p.

    MIKI, B.L.A.; POON, N.H.; JAMES, A.P.; SELIGY, V.L. Possible mechanism for flocculation interactions governed by gene FLO1in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. v. 150 n.2 p.878-889, 1982.

    STRATFORD, M. & KEENAN, M.H.J. Yeast flocculation: quantification. Yeast, v.4, p. 107-115, 1988.

    Anexos

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