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Polymerase Chain Reaction (PCR)

Pedro TeigaRicardo LadeirasSofia Marques

21 Abril 2005

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A invenção da PCR

1983 Kary Mullis

1985 1º paper

1993 Nobel da Química

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PCR, a ferramenta do futuro

Grande quantidade de DNA em pouco tempo. Baixo custo A amostra de DNA não necessita de estar altamente

purificada. PCR pode amplificar uma única molécula de DNA /

RNA. O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de

restrição, sequenciado ou clonado.

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A reacção

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O que envolve a reacção?

DNA Template Tampão da reacção (Tris, iões amónio (e/ou iões de

potássio), iões de magnésio soro de albumina de bovino)

Nucleótidos (dNTPs) Primers DNA polymerase (pex: Taq, Pfu)

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Quantos ciclos?

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Termo-Cicladores

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Funcionou?

Se não…o que fazer?

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Optimização da reacção de PCR

Temperatura Tempos Concentração de

Mg2+ na reacção. Quantidade de

template e de polymerase

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DNA polimerases..

E. coli Taq Pfu – proofreading rTth DNA

Polymerase

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Fidelidade da reacção

A Taq comete ERROS

Qual a importância dos erros?

Como superá-los?

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Concepção dos PCR Primers

Comprimento: especificidade vs eficácia Temp de annealing Composição de bases Extremidade 3’ Regiões repetitivas do DNA Enzimas de restrição Estrutura secundária

Homologias Intra e Inter-primer

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Primers a formar Hairpins e Dímeros

Complementaridade intra-primer – dobra em hairpin:

Dímero de primers (intra ou inter primer).

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Aplicações do PCR

Multiplex PCR Real Time PCR PCR na detecção de polimorfismos e mutações patológicas PCR e a amplificação indiscriminada de sequências de

DNA PCR na amplificação de sequências de DNA desconhecidas PCR assimétrico PCR e clonagem de DNA genómico PCR e clonagem de cDNA PCR e DNA Fingerprinting: casos da Biologia Forense e da

Filiação genética

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Multiplex PCR

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Real time PCR

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PCR usado na detecção de polimorfismos e mutações patológicas

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Para detectar polimorfismos de local de restrição

• O que são polimorfismos?

• Porque existem os polimorfismos?

• Como se detectam esses polimorfismos?

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PCR específico para um alelo e detecção de mutações

• Como se consegue discriminar entre duas sequências alvo que difiram num único nucleotídeo?

• Um só nucleotídeo faz a diferença?

• Como se interpretam os resultados?

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• Qual a vantagem?

PCR permite amplificação indiscriminada de sequências de DNA

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Linker-primed PCR

• Como decorre?

• O que é o linker?

• Que primers são usados?

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• Qual a vantagem?

PCR usado para amplificar uma regiões desconhecidas que flanqueiam uma região previamente caracterizada

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PCR inverso

• Quando se utiliza?

• Como são os primers?

• Como decorre o processo?

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Os produtos amplificados do PCR são usados na sequenciação de DNA

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PCR assimétrico

• Com que fim se utiliza?

• Porquê assimétrico?

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Clonagem de DNA genómico

↓

Clonagem de cDNA

↓

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PCR e DNA Fingerprinting

Exemplo: “locus” D1S80

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PCR e DNA Fingerprinting

Suas principais aplicações:

Biologia forense (ex. confirmação do autor de um crime)

Filiação genética (ex. testes de paternidade)

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PCR e Filiação genética

Pai

Mãe

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O futuro da PCR

PCR ↔ material genéticoFotocopiadora ↔ material escrito

tornando a cópiafácil, barata, acessível

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O futuro da PCR

Com a técnica de PCR iremos desvendar o nosso passado genético, bem como abrir o caminho para um futuro geneticamente traçado.

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Agradecimentos

• Este trabalho foi possível com a ajuda de..

Drª. Clara Monteiro Drª. Susana Pereira, IBMC Drª. Marta Pinto

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Referências

•Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA•James D. Watson, Michael Gilman, Jan Witkwoski, Mark Zoller: Recombinant DNA; second edition; 1992; New York,Scientific American Books•Geoffrey M Cooper: The Cell, a molecular approach; second edition•Alkami quick guide tm for PCR•Rui Pereira; Biologia forense; Nov 2004•A. Silva, A. Fonseca, C. Teixeira, E. Sousa; FCUP; Testes de paternidade•Raymond Dalgleish; Department of Genetics; The Polymerase Chain Reaction (PCR)•Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books