1. ≠ dna e rna dna = Ácido desoxirribonucleico molécula dupla fita pentose: desoxirribose bases...

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TRANSCRIÇÃO 1 Como o DNA Vira RNAm?

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TRANSCRIO1

Como o DNA

Vira RNAm? DNA e RNADNA = cido DesoxirribonucleicoMolcula Dupla fitaPentose: desoxirriboseBases Nitrogenadas: Citosina, Guanina, Adenina e TiminaEncontrado somente no ncleo;Funo: ArmazenamentoO DNA replica e transcrito em um RNAm;Mesma quantidade encontrada em todas as clulas nucleadas.

RNA = cido RibonucleicoMolcula Simples FitaPentose: RiboseBases Nitrogenadas: Citosina, Guanina, Adenina e Uracila.Funo: Transmisso da informao, Catlise (Ribozimas) e Estrutural (RNAt, RNAr)Formado no ncleo mais migra para o citoplasma para ser traduzido numa protena; Varia de clula para clula conforme a taxa da expresso gnica, que se transformar em RNAm

22Principais Diferenas entre Replicao (DNA) e Transcrio (RNAm)Replicao (DNA)

Duas fitas so utilizadas como molde;Semiconservativa;

Fitas de DNA antiparalelas;

Origem de Replicao;

O sentido da transcrio 5 3

Na fita descontnua ocorre a ligao de um iniciador e a formao dos fragmentos de Okasaki;Principal enzima DNA polimerase

Ocorre somente no ncleo das clulas satlites, para reparar as fibras lesionadas; qdo estas foram submetidas a algum tipo de injria.3Apenas uma das fitas utilizada como molde;

Apenas uma fita de DNA transcrita em RNAm;

As sequencias de DNA transcritas, so as sequencias gnicas;

No precisa de um iniciador para comear a transcrio;

Inicia no ncleo das clulas satlites e no ncleo das clulas musculares esquelticas e termina nos citoplasmas destas.

Principal enzima RNA polimerase

A transcrio de RNAm no msculo aumentada, ou regulada por estmulos fisiolgicos e ambientais.Transcrio (RNAm)

Enquanto na Transcrio4Principais Similaridades entre Replicao (DNA) e Transcrio (RNAm)Ambas possuem 3 etapas:IniciaoAlongamentoTerminao

RNA polimerase adiciona os Ribonucleotdeos (A, G, U, C)Na extremidade 3Aumentando a fita de RNAm

5

#ttudobemataqui?#algumadvida?#diferenaentrereplicaoetranscrio?#comovistoanteriormente#posso continuar? 6A clula Eucaritica a unidade morfofuncional de todos os organismos vivos Eucariticos. Est dividida em:Membrana; OrganelasCitoplasma: RNAmNcleo: DNA enrolado em histonas formando os cromossomos.

Na espcie humanaTemos 22 pares de cromossomos1 par de cromossomos sexuaisHomem XYMulher - XXSendo que?

Cada cromossomo

GENE 1GENE 2GENE 3GENE 4Sendo quecada regio gnicaNo gnicasNo gnicasNo gnicas

formadaSequencias regulatrias que se localizam antes dos genes, e onde os fatores de transcrio se ligam.

Uma regio promotora reconhecida pela RNA polimerase e onde inicia a transcrio.

A regio de TRANSCRIO GNICA formada por xons (regies Codificantes, que originaro o RNAm que ser traduzido em uma protena); ntrons (regies no Codificantes, que sero removidas, pelo mecanismo de Splicing do transcrito primrio)

Regio onde a cauda poliA ser adicionada

Existem genes que so expressosConstitutivamente (Genes housekeeping)Expressos em todos os tecidos;

Expressam protenas essenciais para a manuteno da vida, normalmente envolvidos em processos bsicos como:Gerao de EnergiaReplicaoManuteno do Material Gentico

Exemplos: -actina; GAPDH

ReguladosGenes expressos em alguns tecidos, cuja funo est diretamente relacionada funo do rgo/tecido; Ex: Genes expressos no msculo esqueltico;

Genes expressos em somente um tecido, de funo altamente especializada. -globina expressa somente nos eritrcitos

Genes expressos em somente uma clula, e todas as clulas clonais descendentes desta progenitora.Ex: Genes expressos na clula satlite para diferenciao celular em mioblasto aps o trauma por estresse.

10

#ttudobemataqui?#algumadvida?11

GENE 1GENE 2GENE 3GENE 4No gnicasNo gnicasNo gnicasAlm disso, grupos gnicos codificaroSequncias que originaro RNA (constitutivos) com uma funo cataltica

RNAinterferente, snRNA

Sequncias que originaro RNAm (constitutivos, regulados) que originaro uma protena

O que precisamos para que a transcrio ocorra?A transcrio de cada gene cuidadosamente reguladaPara formar produtos gnicos apenas na proporo Necessria

A regulao pode ocorrer em qualquer etapa da transcrio

Grande parte da regulao direciona as etapas de ligao da RNA polimerase, no incio da transcrioE quem faz esta regulao so os FATORES DE TRANSCRIO SELETIVOSEx: Dedos de Zinco (Zinc Fingers)Zperes de Leucina

#ttudobemataqui?#algumadvida?14

Como ocorre a transcrio?15Para que a transcrio ocorra na Etapa de IniciaoOcorre a ligao dos Fatores Proteicos de Transcrio (TF), na regio TATA box, o primeiro (TF) a se ligar o TFIID.

Em seguida, ligam-se os fatores TFIIA, TFIIB, permitindo que a RNApolimeraseII (RNApol II) se ligue,

Logo aps os TFIIF, TFIIE, TFIIH se ligam e libera a RNApol II,

Mas para que a RNApol II transcreva tem que ocorrer a fosforilao de algumas protenas, aps esta fosforilao a RNA, RNApol II, desenrola a Dupla Fita de DNA e a transcrio vai para a fase de Alongao.

16Etapa de Iniciao da Transcrio

17ALONGAMENTO18Nesta Etapa ocorre tambm a adio 7-metil guanosina na extremidade 5 (Cap-5)

Aps a adio de 30 nucleotdeos no RNA primrio ocorre a adio da 7-metil guanosina (7-Mg) na posio 5.

O revestimento de 7-MG contm uma ligao incomum 5-5trifosfato e mais alguns grupos metila.

Os 7-MG so reconhecidos por fatores envolvidos no incio da traduo a protege as cadeias nascentes de RNA da degradao por endonucleases.

TRMINO20Trmino

Ocorre a clivagem do RNA primrio numa regio especfica;

Em seguida uma enzima adiciona a cauda poliA (cerca de 150 a 250 nucleotdeos de Adenina);

Formao do RNA primrio que ainda contm todos os xons e ntrons;

Cab?????22

AT AGORA EU S PRODUZI O RNA PRIMRIO.

MAS EU PRECISO DO RNA MENSAGEIRO, AQUELE QUE CARREGA A MENSAGEM, RNAm, AT O RIBOSSOMO PARA SER TRADUZIDO EM PROTENA.

Como o RNAm produzido?

RNA de interfernciaLuciana Maria de Hollanda33A descoberta do RNAi...Foi precedida pelo estudoCom plantas transgnicas em 1990EUAHolanda

34

Chalcona sintaseThe discovery of RNAi was preceded first by observations of transcriptional inhibition byantisenseRNA expressed intransgenicplants,[141]and more directly by reports of unexpected outcomes in experiments performed by plant scientists in theUnited Statesand theNetherlandsin the early 1990s.[142]

In an attempt to alterflowercolors inpetunias, researchers introduced additional copies of a gene encodingchalcone synthase, a key enzyme for flowerpigmentationinto petunia plants of normally pink or violet flower color.

34Os cientistas esperavam que...Com a hiperexpressoDo gene a planta produziriaMaior pigmentaoTornando-se mais coradasS que ao invs disso...

...ocorreu a diminuio da expresso da chalcona sintase e

tanto os genes inseridos quando os genes endgenos foram hipoexpressos

35

The overexpressed gene was expected to result in darker flowers, but instead produced less pigmented, fully or partially white flowers, indicating that the activity of chalcone synthase had been substantially decreased; in fact, both the endogenous genes and the transgenes were downregulated in the white flowers.

Soon after, a related event termedquellingwas noted in thefungusNeurospora crassa,[143]although it was not immediately recognized as related. 35Investigaes Futuras em PlantasIndicaram que A diminuio da regulaoEra devida a Inibio Ps-TranscricionalDiminuindo a taxa do RNAmDegradando completamente este RNAmCossupresso da expresso gnica36

Transcrito

TraduzidoFurther investigation of the phenomenon in plants indicated that the downregulation was due to post-transcriptional inhibition of gene expression via an increased rate of mRNA degradation.[144]This phenomenon was calledco-suppression of gene expression, but the molecular mechanism remained unknown.[145]

36Depois de algum tempo...Virologistas que trabalhavamResistncia de plantasA certos vrusObservaram um fenmeno parecido

37

Not long after, plantvirologistsworking on improving plant resistance to viral diseases observed a similar unexpected phenomenon. 37Pesquisadores observaram que...Plantas que expressaramProtenas especficas virais mostraramAumento da TolernciaResistnciaInfeco Viral

O que no se esperava quePlantas que transportavam apenasCurtas regies no codificantesDe sequencias de RNA viralMostrariam nveis semelhantes de Proteo38plants expressing virus-specific proteins showed enhanced tolerance or resistance to viral infection,

it was not expected that plants carrying only short, non-coding regions of viral RNA sequences would show similar levels of protection. no se esperavaque as plantasque transportamapenascurtos,regies no codificantesde sequnciasde RNA viralmostrarianveis semelhantes deproteco.

38O que os pesquisadores acreditaram que o RNA viral produzido pelo transgeneDe alguma maneiraTambm inibia a replicao viralDesta maneiraUm experimento reverso foi realizadoPequenas sequencias de genes de plantasForam introduzidas em vrusQue foram infectados em plantasDemonstrou-se que os genes alvosForam suprimidos nas plantas infectadasVrus induzindo o silenciamento gnicoSilenciamento gnico Ps-Transcricional39Researchers believed that viral RNA produced by transgenes could also inhibit viral replication.[146]

The reverse experiment, in which short sequences of plant genes were introduced into viruses, showed that the targeted gene was suppressed in an infected plant. This phenomenon was labeled "virus-induced gene silencing" (VIGS), and the set of such phenomena were collectively called post transcriptional gene silencing.[147]

39Aps essas observaes em plantas...Diversos laboratriosDe vrias partes do mundo Passaram a trabalhar com Esta metodologiaEm outros organismos

1998 Craig C. Mello e Andrew Fire40

Trabalhando com C. elegansAfter these initial observations in plants, many laboratories around the world searched for the occurrence of this phenomenon in other organisms.[148][149]

Craig C. MelloandAndrew Fire's 1998Naturepaper reported a potent gene silencing effect after injecting double stranded RNA intoC. elegans.[150]

In investigating the regulation of muscle protein production, they observed that neither mRNA norantisense RNAinjections had an effect on protein production, but double-stranded RNA successfully silenced the targeted gene. As a result of this work, they coined the termRNAi. Fire and Mello's discovery was particularly notable because it represented the first identification of the causative agent for the phenomenon. Fire and Mello were awarded theNobel Prize in Physiology or Medicinein 2006 for their work.[2]40Os autores estudaram...Um gene relacionadoA musculatura do verme E atravs de uma injeo introduziramUm RNA senseUm RNA antissenseUm RNA duplafita = sense/antissenseObservando que...4142

Apenas a injeo que continha a dupla fita de RNA alterava aForma do verme (fentipo)Eles estudaram um gene 42Alm disso os autores demonstraram que:O silenciamento s ocorre se o RNA injetado for dupla fita (RNAdf).Embora ocorra pequena diminuio da expresso com RNAsf

O silenciamento foi especfico para um RNAm homlogo ao RNAdf

O RNAdf liga-se somente a uma sequencia de RNAm madura, no se ligando ao ntron, ou a sequencias promotorasIndicando um mecanismo citoplasmtico pstranscricional

43First, silencing was triggered efciently by injected dsRNA, but weakly or not at all by sense or antisense singlestranded RNAs.

Second, silencing was specic for na mRNA homologous to the dsRNA; other mRNAs were unaffected.

Third, the dsRNA had to correspond to the mature mRNA sequence; neither intron nor promoter sequences triggered a response. This indicated a posttranscriptional, presumably cytoplasmic mechanism.

43Continuando....O RNAm desapareceuSugerindo que ele foi degradado

Apenas poucas molculas de RNAdfForam suficientes para o total silenciamentoIndicando que o RNAdf atuou cataliticamente

RNAdf espalhou-se entre os tecidosSugerindo a transmisso entre as clulas44Fourth, the targeted mRNA disappeared suggesting that it was degraded.

Fifth, only a few dsRNA molecules per cell were sufcient to accomplish full silencing. This indicated that the dsRNA was amplied and/or acted catalytically rather than stoichiometrically.

Sixth, the dsRNA effect could spread between tissues and even to the progeny, suggesting a transmission of the effect between cells.

Furthermore, Fire and Mello made the remark that RNAi could provide an explanation for a phenomenonstudied in plants for several years: posttranscriptional gene silencing (PTGS). Finally, they ended theirpaper by speculating about the possibility that dsRNA could be used by the organism for physiologicalgene silencing.

44Embora os autores...Demonstrassem tantos pontosEles no falaram se o mecanismo de RNAiAtuava viaTranscricionalPstranscrional

1998 Fire PNAS Demonstrou queRNAm o alvo do RNAdf e queRNAm degradado antes da traduoRNAdf exerce seu efeito no nvel pstranscricional45verquemRNA o alvo paraARNdc(reconhecimentoatravscadeias complementares), eque o mRNA-alvo degradadoantes da traduo, isto ,ARNdcexerce o seu efeitono nvel deposttranscriptional45Ele tambm demonstrou como...Um modelo especficoDe como uma cadeia dupla de RNASeria um alvo especficoPara a degradaoDe um RNAm

Este modelo diferenciava do modeloSimples fitaNo qual um RNAsf antissensee ligava ao RNAmDegradando este

46Ele tambm apresentouum modelo especficomostrando comode cadeia duplade RNApoderia funcionarde uma maneiracataltic apara alvejarhomlogamRNAspara a degradao.

Este modelodiferianotavelmentea partir do modelo simples deanti-sentidoquetempo, o queapenaspreviuinteraco entreuminterferindomolculade RNAde cadeia simplesemRNA.

Podeser acrescentado queno presente documentoPNAS,Fire tambmindicou apossibilidade de que oRNAimecanismopoderia ser umaabordagem especfica"ttica"para a defesaviralem organismos inferiores(a ser comparadocom a respostaglobal nointerferomamferos).

46Fire e Melo Ganhadores do Premio Nobel de 200647

Com o passar dos anos foi descoberto que...Outros organismos tambm possuiamO sistema de RNAi48

Within a year, the presence of RNAi had been documented in many other organisms, including fruities, trypanosomes, plants, planaria, hydra and zebrash 48Experimentos iniciaisCultura de clulas de mamferosElas no reagiram muito bemA longos RNAdfNo respondendo bem ao tratamento

Mas quando os pesquisadores utilizaramRNAdf com 21 a 25 nucleotdeos

Todas as clulas apresentaram resposta495533Sense/antissense49A bioqumica e via do RNAiFoi primeiramente elucidada emUm sistema de embries in vitro Drosophila

E depois de vrios anos concluram que:O longo RNAdf formado quebradoEm pequenos fragmentos que sero Processados e utilizados como moldesPara degradaremUm RNAm especfico50

Este RNA dupla fita longo... clivado em fragmentos menoresDe 20 a 25 nucleotdeosEnzima DICER Fragmentos menoresso conhecidos como RNAsi51DICERThe RNAi pathway is found in manyeukaryotes including animals and is initiated by the enzyme Dicer, which cleaves longdouble-stranded RNA(dsRNA) molecules into short fragments of ~20-25 nucleotides.

51Este RNAsi (smal interfering RNA) ento separado...52...Em fitas simplesThese short double-stranded fragments are called small interfering RNAs (siRNAs). These siRNAs are then separated into single strands and integrated into an active RISC complex. After integration into the RISC, siRNAs base-pair to their target mRNA and induce cleavage of the mRNA, thereby preventing it from being used as atranslation template.[11]52Uma das duas fitas de cada fragmentoConhecida como fita guia do RNAsi incorporada pelo Complexo Indutor de Silenciamento do RNA (RISC)

Enquanto a outra fita degrada

Complexo Indutor de Silenciamento do RNA (RISC)Complexo Formado por muitas protenas ArgonautasNessas protenas se ligam a fita guiaDirecionando o silenciamento gnico

53Ento...which cleave the target mRNA strand complementaryto their bound siRNA.[1]As the fragments produced by dicer are double-stranded, they could each in theory produce a functional siRNA.

However, only one of the two strands, which is known as theguide strand, binds the argonaute protein and directs gene silencing.

The otheranti-guide strandorpassenger strandis degraded during RISC activation.[23]Although it was first believed that anATP-dependenthelicaseseparated these two strands,[24]the process is actually ATP-independent and performed directly by the protein components of RISC.[25][26]The strand selected as the guide tends to be the one whose5' endis least paired to its complement,[27]but strand selection is unaffected by the direction in which dicer cleaves the dsRNA before RISC incorporation.[28]

Instead, the R2D2 protein may serve as the differentiating factor by binding the more-stable 5' end of the passenger strand.[29]5354RNAmAGORISCAGORISCA Fita Guia incorporada pelo complexo RISCO Complexo RISC atravs de sua enzima Argonauta cliva o RNAm degradando-oA fita guia , orienta o local da clivagem do RNAm uma vez que ela semelhante a essa regio54Alm dos RNAsi existem tambm os microRNASo molculas de RNA 19 a 25 nucleotdeosNo codificantes de protenasAgem como reguladoresPstranscricionais da expresso gnicaPlantasAnimas55SO molculas de RNA fita simples de 1925nucleotdeos, no codificadores de protenas, que agem como po-tentes reguladores ps-transcricionais da expresso gnica em plantas eanimais55At o presente momento acredita-se...Que aproximadamente462 miRNAs foram identificadosEm HumanosEstudos bioinformticos estimam queEste nmero supere1000 miRNAs, constituindo uma dasMaiores classes de Reguladores gnicos56At o momento, 462miRNAs diferentes foram identificados em humanos, e estudos bioinformticosestimam que este nmero supere 1000 miRNAs, constituindo uma56Como os miRNA atuam?Ligando-seA regio 3 no traduzida do RNAm alvoImpedindo que ocorra a traduoDe determinada protenaDiminuindo a sua expresso

Estudos recentes demonstraram que:Alteraes da expresso de miRNAOcorrem em diferentes patologias humanasDentre elas o Cncer57Estudos recentesenfatizam a importncia destas molculas ao relatar alteraesna expresso dos miRNAs em diferentes patologiashumanas.Neste artigo, sintetizamos aspectos da biologiadosmiRNAs e as atuais descobertas associando estasmolculas fisiopatologia endcrina e cncer.57Biognese do miRNA (NCLEO)Transcrio de seu gene pela RNApolimerase II

Gerando um longo transcrito de miRNA que aps processado apresentar a cauda poli-A a regio cap 5e uma regio hairpin58GENE miRNARNA polimerase IIBiognese dos miRNAsA biognese do miRNA, esquematizada na figura 1,inicia-se com a transcrio de seu gene pela RNApolimerase II, gerando um longo transcrito de miRNA

primrio (pri-miRNA) contendo cap 5 e cauda poli(A)(7). O pri-miRNA apresenta uma estrutura hairpin emseu arcabouo que clivada ainda no ncleo pela RNaseIII, Drosha, e seu cofator DGCR8 (do ingls DiGeorgesyndrome critical region gene 8), gerando uma molculaprecursora do miRNA maduro denominada pr-miRNA,com cerca de 70 nucleotdeos (8). Em seguida, o prmiRNA transportado rapidamente ao citoplasma pelaexportina-5(Exp5), protena de exportao nuclear queutilizaRan-GTP como co-fator (9). No citoplasma, opr-miRNA processado pela RNase III, Dicer, gerandoummiRNA fita dupla de aproximadamente 22 nucleotdeos(10). Este produto incorporado a umcomplexomultimrico denominado RISC (do inglsRNA-inducedsilence complex),que inclui as protenasArgonautascomo principais componentes. Apenas umadasfitas do duplexde miRNA permanece no complexoRISC para controlar a expresso ps-transcricional degenes-alvo (11). A expresso alterada de componentes damaquinaria de biognese dos miRNAs como Drosha,Dicer e Argonautas, tem sido associada a diferentes tumoreshumanos, destacando a importncia desta via no funcionamentocelular adequado (12).58Sofre a ao da enzima DROSHA e seu cofator DGCR859POLI-ACAP-5Pri-miRNADROSHADGCR8POLI-ACAP-5Gerando uma molcula precursora de miRNA madura denominada pr-miRNA que sair do ncleo e ser transportadaPara o citoplasmaPr-miRNA70 nucleotdeosA biognese do miRNA, esquematizada na figura 1,inicia-se com a transcrio de seu gene pela RNApolimerase II, gerando um longo transcrito de miRNA

primrio (pri-miRNA) contendo cap 5 e cauda poli(A)(7). O pri-miRNA apresenta uma estrutura hairpin emseu arcabouo que clivada ainda no ncleo pela RNaseIII, Drosha, e seu cofator DGCR8 (do ingls DiGeorgesyndrome critical region gene 8),

gerando uma molculaprecursora do miRNA maduro denominada pr-miRNA,com cerca de 70 nucleotdeos (8). 5960EXP-5NCLEOCITOPLASMARAN-GTPo prmiRNA transportado rapidamente ao citoplasma pela exportina-5 (Exp5), protena de exportao nuclear que utiliza Ran-GTP como cofator 60No citoplasma o pr-miRNASer clivado pela enzima DICERGerando um miRNA fita duplaDe aproximadamente 22 nucleotdeos61DICERNo citoplasma, opr-miRNA processado pela RNase III, Dicer, gerandoum miRNA fita dupla de aproximadamente 22 nucleotdeos(10).

61Este miRNA separado em fitas simples62Este produto incorporado a umcomplexomultimrico denominado RISC (do inglsRNA-inducedsilence complex),que inclui as protenasArgonautascomo principais componentes. Apenas umadasfitas do duplexde miRNA permanece no complexoRISC para controlar a expresso ps-transcricional degenes-alvo (11).6263

Ou pelo bloqueio da traduo de protenasa complementaridade no necessita ser completa

o que indica que um nico miRNA pode regular centenas de genes, e cada gene-alvo pode ser regulado pormltiplos miRNA, demonstrando a complexidade dessa rede de regulao gnica.

6464

65COMO ISSO PODE SER UTILIZADO A NOSSO FAVOR?A descoberta do processo de regulao gnica atravs de RNA interfernciarevolucionou a forma como se estuda o papel de genes especficosna biologia.

Porque?66Porque?Porque o uso de RNAduplafita (RNAdf) exgeno como ferramentaReduz a expresso de determinados RNAmDiminuindo a produo de sua protenaAlterando muitas vezes a funo celularComo o RNAm no estar sendo expressoVc poder estudarGene.67O uso de molculas deRNAdf exgenas como ferramenta podereduzir a expresso de genes especficos (efeito conhecido como knock-down),de forma que as alteraes causadas por essa estratgia possibilitam avaliar quaisfunes esse gene desempenha na clula. Nesses experimentos, a sequncia damolcula deRNAdf definida pelo pesquisador para interferir no seu gene-alvo preferido. Essa estratgia tambm pode ser usada diretamente in vivo (emanimais ou mesmo em humanos), e da a possibilidade de desenvolvimento defrmacos (Tiemann& Rossi, 2009).67Alm disso, uma tcnica que utilizada68

Possibilitando o desenvolvimento de Frmacosduas abordagens distintas podem ser usadasPara silenciar RNAm alvos, ou diminuir a expresso de protenas alvo, ou tentar estudar genes alvo.PRIMEIRAVetores ViraisSo introduzidos nas clulasExpressaro genesQue sero transcritos em molcus RNAdfSimilares ao miRNAEssas molculas parecidas com miRNA ficaram conhecidas como shRNA (Short Hairpin)_69

Na primeira,vetores genticos, em geral derivados de vrus (como adenovrus, retrovrus ou vrus adenoassociados), so transduzidos nas clulas, de modo a expressar genes que so transcritos em molculas deRNAdf na forma de grampo (similares aosmiRNA). Essas molculas so conhecidas como shRNA (do ingls short hairpinRnA) e tm como alvo o gene que se deseja silenciar69shRNAClivado pela protena DROSHAProcessado pela maquinaria do RNAiTer como resultadoDiminuio da expresso do que se quer

Problema desta metodologia a produoDe vetores viraisO que no um processo simplesDo ponto de vistaFarmacutico

Embora existam outros vetores sendo testados em humanos expressando shRNA70. O shRNA clivado pelaprotena Drosha e assim processado pela maquinaria deRNA interfernciacelular. Apesar de esse tipo de abordagem requerer a produo de vetores virais,o que no um processo simples do ponto de vista de produo de frmacos,ainda assim, como veremos adiante, h algumas estratgias teraputicas que estosendo testadas, como protocolos clnicos em humanos, empregando vetores queexpressam shRNA

70Segunda abordagemPequenas molculas de RNAdfConhecidas como RNAsiIntroduzidas em culturas de clulasPor diversos tipos de metodologiasPermitem a degradao especficaDo RNAm alvo

Atualmente vrias empresas de biotecnologiaOferecem molculas de RNAsiPara qualquer RNAm Humano ou de CamundongoQue se pretende silenciar

71Em uma segunda abordagem, pequenas molculas de RNAdf podem serintroduzidas diretamente nas clulas em cultura, visando degradao especficado gene-alvo. Essas molculas so conhecidas como siRNA (small interferingRnA) e podem ser introduzidas na clula, por vrios tipos de metodologias,para o silenciamento de seu gene-alvo.

Atualmente, vrias empresas debiotecnologia oferecem molculas de siRNA, para qualquer gene humano(ou camundongo) que o pesquisador pretenda silenciar. 71Uma caracterstica importante queO tamanho do fragmentoTem que ter sempre entre 19 e 30 pbPois fragmentos maioresInduzem respostas interferon inespecificas nas clulas animaisGerando apoptose celular 72Uma caractersticaimportante o tamanho da duplex que deve ter de19 a 30 pares de base, umavez que tamanhos maiores podem induzir respostas interferon inespecficas emclulas animais.

72Cultura de ClulasA introduo da molcula de siRNA feita atravs da formao Complexos dessas comPolmeros QumicosLipdios Catincos

O complexo endocitado pela clulaRNAdf so liberados no citoplasmaSendo liberados pela maquinariaRNAiPromovendo o silenciamento Do RNAm alvo73Em cultura de clulas, a introduo de molculas de siRNA , em geral,feita atravs da formao de complexos dessas duplexes com polmeros qumicosou lipdeos, normalmente catinicos. O complexo endocitado pelas clulas e asduplexes de RNA so liberadas no citoplasma, sendo processadas pela maquinariadeRNA interferncia, promovendo o silenciamento do gene-alvo. 73Reavivando a Memria74

A utilizao de RNAsiTem sido amplamente empregadaNos estudos de genmica funcionalEm distintos testes clnicosDevido ao silenciamento gnicoEspecfico e robusto desta molcula

A fcil manipulao e a existncia de RNAsi para qualquer RNAm Do genoma humanoTornaram acessvel o uso dessaFerramenta Por diferentes grupos de pesquisa aplicada e bsica75A utilizaode siRNA tem sido largamente empregada em estudos de genmica funcional e em distintos testes clnicos em razo do silenciamento gnico especfico e robusto induzido por essas molculas. A fcil manipulao e a existncia de sequncias desiRNA para qualquer gene do genoma humano tornaram acessvel o uso dessaferramenta por diferentes grupos de pesquisa bsica e aplicada. 75Interferindo na expresso gnica in vivoA descoberta do mecanismo de RNAiEm clulas humanas recenteMas rapidamente verificou-se o seu usoComo terapia em animais

Maior parte dos testes pr-clnicos76

A descoberta dos mecanismos de RNA interferncia em clulas humanas relativamente recente, mas, apesar disso, rapidamente verificou-se que o usodeRNAdf como ferramenta tambm pode ser feito in vivo, diretamente emanimais. Obviamente, a maior parte desses testes pr-clnicos tem sido feita emcamundongos, mas animais maiores, como macacos, tambm tm sido usados,e os resultados tm sido promissores. 76Isso estimulou o desenvolvimento......de diversos estudos em humanosE vrios protocolos clnicos Esto testados para

77

Isso estimulou o desenvolvimento deestudos diretamente em humanos, e vrios protocolos clnicos j esto sendotestados. O potencial teraputico de silenciamento atravs deRNA tem sidoinvestigado tendo como alvo vrios tipos de doenas, como cncer, doenasrespiratrias, inflamao, doenas neurolgicas, autoimunes e no combate aprocessos infecciosos (Figura2). 77Alguns protocolos clnicos em fase IQue testam a segurana do uso em humanosJ foram concludos e se verificou que A molcula de RNAsiForam introduzidas em pessoasSem que se apresentasse efeito txicoCom silenciamento do RNAm alvo.78Alguns protocolos clnicos em fase I, que testama segurana do uso de terapias em humanos, j foram concludos e se verificouque molculas de siRNA foram introduzidas em pessoas sem que se verificasseefeito txico. Mais do que isso, em vrios casos identificou-se o funcionamentodessas duplexes no silenciamento do gene-alvo, como desejado.

78Alm disso...O desenvolvimento de terapias Baseadas em RNAi tornou-seUm campo promissorUma vez que a inibio deDeterminadas protenas no teve sucessoPela farmacologia tradicional79O desenvolvimento de terapias baseadas emRNAi tornou-se um campode pesquisa atrativo e promissor sobretudo nos casos em que a inibiode determinadas protenas no teve sucesso pelos mtodos farmacolgicostradicionais. 79O desenvolvimento de RNAdfS depende do conhecimenoDa sequencia do RNAm alvoSendo a droga a ser desenvolvida Extremamente mais simplesUma vez que no se precisa conhecerA estrutura cristalogrfica da protena

80Alm disso, como o desenvolvimento de duplexes deRNA sdepende do conhecimento da sequncia do gene-alvo, o desenvolvimento dessasdrogas extremamente simples em relao ao tradicional drug design, no qualh necessidade de conhecimento da estrutura cristalogrfica da protena-alvo, oque no garantia de sucesso em determinar os ligantes ativos nessas estruturas.

80Apesar de...Existirem casos que os RNAdfAtuam em mais de um RNAmEfeito conhecido como off-target

Mas vrios protocolos experimentaisDemonstraram a especificidadeDada pela sequencia dessas molculasO que estimula novas pesquisasNa rea

81Apesar de existirem casos nos quais as duplexes podem atuar em alvos diferentesdo previsto (efeito conhecido como off-target), vrios protocolos experimentaistm demonstrado a especificidade dada pela sequncia dessas molculas, o queestimula novas pesquisas na rea.

81Em geral...Os trabalhos utilizam as metodologiasJ descritas para os procedimentosDe terapia gnica tradicional

Entretanto, algumas diferenas entre o uso dessas duas abordagens so claras e devem ser levadas em conta na escolha da metodologia

82Em geral, os trabalhos empregam as metodologias j bastante investigadaspara introduo deDNA em organismos, em procedimentos de terapia gnicatradicional. Entretanto, algumas diferenas entre o uso dessas duas abordagensso claras e devem ser levadas em conta na escolha da metodologia82A molcula de RNAsi muito menor que a molcula de DNAO que facilita a sua interiorizao

Alm disso, o RNAsi uma molcula muito mais instvel in vivo

Essa caracterstica exigiu diversos estudos em modificaes qumicas que aumentam sua estabilidade no organismo, sem prejudicar a ao dessas molculas como frmacos.

83. A molculade siRNA muito menor (entre 19 e 30 pares de bases), o que facilita suaentrega em relao aos vetores genticos dependentes de DNA ou RNA (emgeral alguns milhares de pares de base). Apesar disso,RNA uma molcula muitomais instvel, sendo degradada in vivo porRNAse. Essa caracterstica exigiudiversos estudos em modificaes qumicas que aumentam sua estabilidade noorganismo, sem prejudicar a ao dessas molculas com frmacos.

83Vias de AdministraoRNAsi ou RNAsh Atravs de vrias vias de administraoO que depender do RNAm do tecido-alvoA ser analisado ou avaliado

Aplicaes IntravenosasRNAsi ou RNAsh Diretamente para o FgadoOnde interiorizadoPelas clulas84Os testes com animais empregam siRNA ou shRNA atravs de vriasvias de administrao, o que depende do gene e do tecido-alvo. Por exemplo,aplicaes intravenosas possibilitam que a duplex seja direcionada especialmenteao fgado, onde interiorizado nas clulas.84Vias de AdministraoIntraoculargarante um efeito direto nesse rgo, com a vantagem do olho ser um compartimento de tamanho limitado, o que possibilita o uso de poucas molculas, que ainda so efetivas no silenciamento gnico.

Inalaomuito sucesso o emprego de aplicao de RNAdf atravs de inalao quando o alvo so as vias areas.85Vias de AdministraoPeleo que possibilita um alcance em vrios pontos do organismo, ainda que preferencialmente em tecidos mais superficiais.

Mas como esses RNAdf so administrados?86VetoresVrus

Complexos Qumicos

Nanopartculas

Bactrias

87Interferindo no genoma humano com fins teraputicosApesar de sabermos que o mecanismoDe RNAi existe em clulas humanasDesde 2001 surpreendente como Protocolos clnicos em seres humanosEmpregando esta tcnica foram desenvolvidos rapidamente

88Apesar de sabermos que o mecanismo de RNA interferncia existe em clulashumanas h relativamente pouco tempo (desde2001), surpreendente comorapidamente foram iniciados protocolos clnicos em seres humanos empregando RNAi. 88Essa rapidez e relativo sucessoPermitem prever que em poucos anosTeremos essas molculas sendo ComercializadasEm nossas FarmciasAplicadas em nossos Hospitais.

Entre as principais indicaes de uso RNAiDestacam-seTerapias oftalmolgicas89Essa rapidez e relativo sucesso em alguns desses protocolos permitemprever que, em poucos anos, teremos essas molculas sendo comercializadas emnossas farmcias e/ou aplicadas em nossos hospitais (Tiemann& Rossi, 2009).Entre as principais indicaes de uso deRNA interferncia, destacamse

aquelas envolvidas em terapias oftalmolgicas. 89Isso se deve porqueA compartimentalizao ocularPermite injees diretas Na cavidade vtrea que so livres De nucleases portantoAs RNAsiSo facilmente internalizadas pelas clulas-alvoVitravene, Novartis e Macugen, PfizerRetinite por Citomegalovrus90Isso se deve basicamente compartimentalizao ocular, que permite a administrao direta com injeesna cavidade vtrea. doena macular relacionada idade O compartimento ocular livre de nucleases e molculas desiRNA so internalizadas nas clulas-alvo90Alm disso,Com duplexes de siRNAOs testes clnicos tm se concentrado no tratamento de doena macular relacionada idade

Testes clnicos de fase II/III, Empregando 217 pacientes, indicaram uma melhora na acuidade visual em dois teros desses, demonstrando que essa tecnologia Pode estar prxima de ser aprovada para comercializao91Protocolo Clnico na Fase IIEst sendo realizado para combater a infeco respiratria por vrus sincicialRNAi so inalados pelos pacientes88 indivduos que receberam o RNAiNo foram infectados em relao aqueles que receberam o placebo92Testes clnicos com88 indivduos adultossadios demonstraram que as molculas de siRNA foram seguras e houve nveissignificativamente menores de infeco em relao a indivduos que receberamplacebo92A corrida do ourono desenvolvimento de novas terapias com RNAiA descoberta dos mecanismos de RNA interferncia, apesar de recente, provocou uma verdadeira revoluo na forma como estudado o funcionamento dos genes nas clulas e tambm abriu perspectivas de interveno direta na ao gnica in vivo.

Em vrios casos de doenas humanas, ocorre aumento de expresso de determinados genes, e o controle desses pelo silenciamento aparece como uma esperana na obteno de novas formas de terapia.93Esforos para uso dessa nova biotecnologia na clnica tm correspondido a um dos mais importantes exemplos recentes de medicina translacional, na qual o teste de laboratrio transferido rapidamente para o leito do paciente.

Os desafios ainda so grandes, havendo necessidade de novas estratgias para maximizar a ao das molculas efetoras dentro das clulas, assim como dos mecanismos de administrao e entrega da molcula aos rgos-alvo.94Vrias so as estratgias propostas, na teoria, para o direcionamento dessas molculas de modo a garantir melhor especificidade no tecido-alvo, mas h necessidade de testes que possibilitem ademonstrao de efetividade na prtica.

Os desafios, porm, no parecem assustar as grandes empresas farmacolgicas do mundo inteiro

Uma vez que esto dispostas a investir bilhes de dlares nesta nova metodologia.

Embora esta metodologia deve ser analisada com cautela, visto que ainda requer intenso trabalho de pesquisa em todo o processo de elaborao de protocolos teraputicos95