fase pré-analítica (60% -70%) ◦ coleta ◦ transporte fase analítica (20% - 30%) fase...

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Fase Pré-analítica (60% -70%)◦ Coleta◦ Transporte

Fase analítica (20% - 30%)

Fase pós-analítica (10%)

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Realizada do local real da infecção; Obtenção de uma quantidade suficiente de

amostra Utilização de dispositivos apropriados para

a coleta do material Obtenção de cultura antes da administração

de antibióticos Identificação do material

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Seringa:◦ Exsudatos frescos ou amostras líquidas:

procedimento válido para amostras enviadas para análise logo após a coleta.

Frascos :◦ Frascos de boca larga com sistema de

fechamento eficiente contra vazamento e contaminação de material

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Swab

◦ Algodão estéril◦ Rayon ou Dracon◦ Alginato de cálcio◦ Solução salina, meio de cultura Amie (com ou

sem carvão),Stuart e Clairy Blair.

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Amostra recebida em formalina; Coleta de escarro de 24 horas; Único swab para vários fins; Recipiente impróprio, contaminado ou com

vazamento Placas de cultura com crescimento

excessivo ou secas.

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Seleção de meios de cultura primários

Transferência e cultura das amostras clinicas

Interpretação das culturas e análise dos resultados.

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Destinados para a reprodução, isolamento e análise dos microorganismos de interesse medico.

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Compostos por◦ Hidrolisados de proteínas: fonte de C e N◦ Carboidratos: ◦ Tampões◦ Enriquecimento◦ Inibidores◦ Indicadores de pH◦ Ágar: agente solidificante◦ Substratos para ação enzimática

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Crescimento:

◦ Ágar chocolate◦ Ágar sangue◦ Ágar Cled◦ Ágar Mueller Hinton

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Ágar chocolate: meio nutritivo maioria bactérias, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hematina.

Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp. 

Ágar sangue: meio não seletivo, crescimento de bactérias gram – e +

Cled- Ágar cystine lactose eletrolyte deficient: meio que permite o crescimento de gram+ e gram- .

Ágar Mueller-Hinton é um meio de cultura microbiológico que é freqüentemente usado para testes de susceptibilidade antimicrobiana.

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Ágar Manitol Ágar Mac Conkey, EMB Ágar Salmomella Shigella Ágar Sabouraud Ágar Bili-Esculina Ágar Dnase Ágar TSI Ágar Lowestein Jensen

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Ágar Manitol - Famílias Micrococcaceae

Ágar Mac Conkey, EMB - Crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de lactose

Ágar Salmomella Shigella

Ágar Sabouraud - Identificação de fungos patogênicos e leveduras.

Ágar Bili-Esculina - Isolamento e identificação de estreptococos.

Ágar Dnase - Recomendado para a detecção da atividade desoxiribonuclease de bactérias e fungos. Staphylococcus aureus.

Ágar TSI - Diferenciação de patógenos entéricos (E. coli) pela capacidade de determinar a fermentação do carboidrato.

Ágar Lowestein Jensen - Mycobacterium tuberculosis

Azul de Toluidina

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Caldo tetrationato Caldo selenito Caldo nitrato Caldo malonato Caldo triptona e SIM Caldo BHI

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Caldo tetrationato Meio de enriquecimento para uso com Salmonella spp.- Cosposto por sais de bile impede o crescimento de bactérias Gram-positivas e o iodo proporciona o impedimento de crescimento de espécies fecais.

Caldo selenito. Diferenciar e identificar vários tipos de bactérias especialmente a família Enterobacteriaceae. Inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos.

Caldo malonato usado para a diferenciação de bactérias gram-negativas com base na habilidade de utilizar malonato e produzir ácido pirúvico.

Caldo triptona e SIM Metabolizar o triptofano em indol. Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, Haemophilus e anaeróbios.

Caldo BHI. Caldo infusão de cerebro e coração e um meio altamente nutritivo empregado para a propagação de cocos.

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Ágar Nutriente Salina tamponada Clary Blair Meio Stuart Água peptonada

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Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da população.

Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. A taxa de crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em questão.

Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem.

Declínio: A maioria das células está em processo de morte

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O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela fórmula abaixo:

N=No.2n, onde N= número final de células, No= número inicial de células, n= número de gerações.

n= log(N) - log(No)/0.301

g = t/n , onde g= tempo de geração, t= tempo de crescimento e n= determinado acima.

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Tamanho: diâmetro em milímetros Forma Elevação Margem Cor: branca, amarela, preta, camurça,

laranja... Superfície: brilhante, opaca Densidade: opaca, translúcida, transparente Consistência: viscosa, butirácea,

membranosa

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Odores: tênis sujo (citrobacter spp.), pútrido ( Clostridium difficile), pêlo molhado

( Haemophillus spp), chocolate queimado ( Proteus spp)

Mudanças de cor no meio: indicadores de pH

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Avaliação das colônias

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Avaliação das colônias

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Coloração de Gram Coloração ácido resistente Coloração fluorescente (UV) – fluorocromos

(ag/ac) Laranja de acridina Azul de Toluidina – biópsia de pulmão e

secreções respiratórias

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Gram Negativa

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Gram positiva

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Identificação das características bacterianas referente ‘a coloração da parede celular e sua diferenciação em bactérias Gram positivas e Gram negativas;

Verificação da forma, arranjo e tamanho das bactérias .

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Solução de cristal violeta◦ Cristal violeta 1g◦ Ácido fênico 2 g◦ Álcool absoluto 10 mL◦ Água destilada 100 mL

Lugol◦ Iodo 1 g◦ Iodeto de potássio 2 g◦ Água destilada 300 mL

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Álcool acetona◦ Álcool 800 mL◦ Acetona 200 mL

  Fucsina

◦ Fucsina 2,5 g◦ Álccol etílico 100 mL◦ Água destilada 90 mL

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Os corantes devem ser armazenados em frasco de vidro âmbar em locais onde as condições do ambiente sejam favoráveis, com temperaturas entre 20 e 25ºC (temperatura ambiente) e sem teor de umidade.

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Amostras recebidas em Swab

◦ Rolar delicadamente o swab sobre a superfície de uma lâmina limpa

◦ Se o swab estiver seco, colocar um pequeno volume de solução fisiológica estéril, agitar vigorosamente, comprimindo-o contra a parede do tubo e utilizar essa suspensão para o preparo do esfregaço.

◦ Deixar secar ao ar e fixar ao calor.

◦ Corar pelo método de Gram

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As amostras recebidas em seringa devem ser transferidas para um tubo estéril, homogeneizadas para a execução de um esfregaço em lâmina.

Se a amostra for muito espessa, diluir em solução fisiológica estéril antes de fazer o esfregaço.

Para as amostras recebidas em frascos ou tubos estéreis, selecionar a parte mais purulenta e confeccionar o esfregaço em lâmina. Espalhar a amostra em ¾ da lâmina e formar o esfregaço fino.

Deixar secar ao ar e fixar com calor. Corar pelo método de Gram

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Colocar uma pequena gota de solução fisiológica sobre a lâmina.

Com a alça bacteriológica, tocar a superfície de uma colônia isolada e emulsionar gentilmente na gota de solução fisiológica colocada sobre a lâmina.

Deixar secar ao ar e fixar no calor

Corar pelo método de Gram.

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Após centrifugação (3.000 a 5.000 rpm / 15 min.) remover o sobrenadante e deixar aproximadamente 0,5 mL do sedimento.

Homogeneizar e confeccionar o esfregaço (+/- 50 uL do material – 1 gota)

Deixar secar ao ar e fixar no calor.

Corar pelo método de Gram

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Flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois lados, “cortando” lentamente a chama do bico de Bunsen;

Flambar a alça de platina até o rubor e esfriá-la.

Tomar o tubo de cultura com a mão esquerda e com os dedos mínimo e anelar da mão direita remover a tampa do tubo;

Flambar a boca do tubo de cultura;

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Introduzir a alça de platina, apreendida entre o polegar e o indicador da mão direita, no interior do tubo até tocar o meio de cultura

Flambar novamente a boca do tubo de cultura;

Fechar o tubo e colocá-lo na estante; Tomar uma lâmina (anteriormente

preparada) com a mão esquerda e depositar no centro da mesma uma amostra de suspensão bacteriana;

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Espalhar o material com movimentos de rotação da alça de platina, para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme, secar naturalmente;

Manter o esfregaço nas proximidades da chama.

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Fixar o esfregaço, “cortando” lentamente a chama por 3 vezes, a fim de que o material fique bem aderente à lâmina. A fixação é sempre feita do lado contrário ao esfregaço bacteriano.

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Cobrir com cristal violeta e deixar agir por 1 minuto;

Cobrir com solução de lugol por 1 minuto; Lavar com água tomando cuidado pra que o

jato não incida diretamente no material a ser analisado.

Descorar com álcool acetona;

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Lavar com água;

Corar com fucsina fenicada por 30 segundos;

Lavar com água, secar e observar em objetiva de 100 x com óleo de imersão.

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Bactéria Gram positiva – roxo escuro

Bactéria Gram negativa – avermelhadas (rosada)

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O cristal violeta cora tanto a parede celular das bactérias Gram + quanto Gram -.

O lugol tem ação de fixador, sendo absorvido por ambas, formando assim o complexo cristal violeta-iodo ( CV-I) corando a bactéria de roxo.

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O álcool acetona funciona como um solvente

atuando na porção lipídica da parede celular das bactérias Gram -, resultando numa porosidade e permeabilidade aumentada, extraindo desta forma o complexo CV-I, descorando as células.

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O álcool acetona, desidratando a espessa camada de peptideoglicano das bactérias Gram +, provoca a contração dos poros, retendo desta forma o CV-I, mantendo as células coradas.

A última etapa do processo é tratamento com o corante fucsina que cora a parede celular das Gram -, tornado-as avermelhadas ou rosa.

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Gram positiva

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Gram negativa